黄柄曲霉的次生代谢产物分析及抗肿瘤活性研究

以富产细胞松弛素的黄柄曲霉为研究对象,对其追踪分离,从中获得单体细胞松弛素类化合物,并进行抗肿瘤抗菌活性测试,期待发现结构新颖、活性显著的细胞松弛素类化合物,为抗肿瘤抗菌药物研发提供模板分子.研究采用PDA培养基分离黄柄曲霉菌,用真菌2号培养基发酵,乙酸乙酯萃取发酵物,经硅胶色谱、ODS、凝胶柱色谱分离纯化,再通过高效液相色谱进行单体化合物的制备.利用核磁共振、质谱解析化合物结构后,选择肿瘤细胞A549、H1299为实验对象,采用CCK8法测定单体化合物的抗肿瘤活性.结果表明化合物1、化合物2、化合物3对肿瘤细胞A549、H1299具有一定的细胞毒性,其中化合物1(Cytochalasin E)具有较强的细胞毒性,可以较好的诱导肿瘤细胞凋亡.

金属离子对黄柄曲霉生长和抗真菌抗生素合成的影响

不同的金属离子对兼性海洋霉菌黄柄曲霉 1 79的生长有不同的影响。在 0 0 0 2mol/L的浓度下 ,Hg2 +、Ag+和Cr3+能强烈抑制该菌的生长 ,Pb2 +、Sr2 +、Co2 +、Al3+对其生长有一定的抑制 ,生长量低于对照 ;Mn2 +、Ba2 +、Zn2 +对其生长没有明显影响 ;Cu2 +对该菌的生长有微弱的促进作用 ,菌体生物量略高于对照 ;不同的金属离子对曲霉 1 79抗真菌抗生素 1 79M合成有不同的影响。与对照相比 ,Ba2 +对其产量没有影响 ;Al3+、Zn2 +、Sr2 +有一定的抑制作用 ,其发酵相对效价分别为对照的 81 4%、 5 5 5 %和 6 5 %;0 0 0 2mol/L的Mn2 +和Pb2 +能强烈抑制此抗生素的合成 ,在添加 0 0 0 2mol/LMn2 +和Pb2 +的培养基中 ,虽然菌体生长良好 ,但无 1 79M产生 ;Co2 +和Cu2 +则有明显的促进作用 ,当培养基中添加0 0 0 2mol/L的Co2 +时其发酵相对效价提高到 2 6 1 4%;当培养基中添加 0 0 0 3mol/L的Cu2 +时其发酵相对效价提高到 3 5 0 2 %。Co2 +和Cu2 +对发酵的促进效应是相互拮抗的。

黄柄曲霉ASD对辣椒疫病根际真菌菌群结构及土壤功能的影响

为阐明辣椒疫病生防菌黄柄曲霉ASD的土壤微生态调控机理,本研究利用化学方法与Illumina HiSeq平台分析了ASD菌液对罹病辣椒根际土壤特性及真菌多样性的影响。结果表明,ASD菌液的施入可以明显提高罹病土壤硝态氮与有效钾含量,降低铵态氮含量与N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶活性。ASD菌液增加了罹病辣椒根际土壤真菌多样性与丰度,从而改变了辣椒根际优势真菌群落构成。优势种群与发病率相关分析结果表明,丰度上升的嗜热链球菌属与嗜热毁丝霉属等9个物种与发病率呈负相关,丰度降低的斜盖伞属及近地伞属与发病率呈正相关。与环境因子相关性分析表明,有效钾、硝态氮的含量与ASD处理的土壤真菌多样性呈正相关,并正向影响锥盖伞属等10个物种,铵态氮含量及N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶活性则反之。综上所述,黄柄曲霉ASD可以增加辣椒疫病根际土壤真菌多样性,改变土壤营养状况与优势真菌种群结构,从而降低辣椒疫病的发病率。结果可为菌株ASD应用于生产实践提供理论基础。

黄柄曲霉ASD次生代谢产物的鉴定及抑菌活性

为明确土壤来源的黄柄曲霉ASD次生代谢产物中的抑菌物质及其生物活性,利用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相色谱对ASD发酵液的二氯甲烷粗提物进行纯化,运用核磁共振及高分辨质谱技术,结合文献报道数据对化合物的结构进行鉴定,利用X-射线单晶衍射验证鉴定结果;采用含药稀释平板法及菌丝生长速率法测定化合物对辣椒疫霉菌、大斑凸脐蠕孢菌和禾生刺盘孢菌等9种病原真菌的抑菌活性。结果表明,从ASD发酵液中分离获得已知活性抑菌物质为sulochrin和4,5-二甲基间苯二酚。其中,sulochrin对辣椒疫霉菌、大斑凸脐蠕孢菌和禾生刺盘孢菌有较好的抑制作用,4,5-二甲基间苯二酚只对辣椒疫霉菌具有较好的抑制作用,两者对灰葡萄孢菌、玉蜀黍尾孢菌和新月弯孢菌等6株致菌抑菌效果不明显或无抑制作用。

黄柄曲霉对杨梅栲胶的降解过程研究

为研究微生物对缩合类单宁的降解过程,利用黄柄曲霉（Aspergillus flavipes）对杨梅栲胶溶液进行降解。分别对降解过程中杨梅栲胶溶液的化学需氧量（chemical oxygen demand,COD）值、总酚含量、聚黄烷醇含量以及黄柄曲霉菌体的生物量进行测定,研究黄柄曲霉对杨梅栲胶溶液的降解过程;通过测定降解过程中杨梅栲胶溶液的pH值、电导率和粒径,反映降解过程中杨梅栲胶性质的变化。实验结果表明,黄柄曲霉生长在降解开始后的1~2d处于稳定期,杨梅栲胶降解不明显;在3~8d处于对数期,杨梅栲胶被快速降解,其中的小分子酚类物质首先被消耗,然后聚黄烷醇再被消耗,溶液COD值迅速降低;在9~15d处于稳定期,杨梅栲胶降解速度减缓。降解后杨梅栲胶溶液的COD、总酚和聚黄烷醇去除率分别为18.6%、42.7%和41.3%,同时溶液的pH值从4.61上升到5.61,电导率和粒径分别从608μS/cm和122.2nm降低到552μS/cm和45.8nm。本研究可为大分子植物单宁的生物降解提供参考,并为生产小分子单宁化合物以及降低单宁的收敛性和抗营养性提供新的方法。

黄柄曲霉ASD菌株抑菌谱测定及抑菌物质初探

采用对峙培养法对黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)ASD菌株抑菌谱进行了测定,试验结果表明:黄柄曲霉ASD菌株具有较广的抑菌谱,对辣椒疫病菌(Phytophthora capsiciLeonian)、番茄晚疫病菌(Phytophthora infestans)有较好的抑制作用。ASD菌株发酵液对辣椒疫病菌的抑菌带宽度为7.4mm,抑菌活性较强。ASD菌株的发酵液经50%硫酸铵饱和度沉淀并透析后得到的抑菌物质对辣椒疫病菌的抑菌效果最好,抑菌活性可达80.78%,且抑菌物质为蛋白类物质。

黄柄曲霉ASD胞外酶活性及其性质

为了明确黄柄曲霉ASD对辣椒疫霉菌的生防机理,开展了ASD粗酶液在不同含量致病疫霉菌胁迫下四种胞外酶活性变化,并测定其酸碱稳定性与溶解性。结果表明,胁迫后纤维素酶与木聚糖酶活性显著提高到较高水平,且与底物含量正相关,第3~4 d时酶活性最高;蛋白酶及β-1,3葡聚糖酶活性虽也提高,但幅度小于纤维素酶与木聚糖酶活性变化,且酶活性低。结果说明纤维素酶与木聚糖酶的溶菌作用是ASD抑制辣椒疫霉生长的主要生防机制。此外,ASD粗酶液具有较好的耐酸碱性,在中性与微酸环境中抑菌活性较高;抑菌物质为亲水性物质,但会被乙醇破坏。研究结果可为黄柄曲霉ASD的开发应用提供依据。

油菜内生真菌黄柄曲霉CanS-34A对核盘菌的拮抗性

以油菜内生真菌黄柄曲霉CanS-34A为研究材料,通过平板对峙培养、离体叶片法及盆栽试验等试验探究CanS-34A的抑菌谱以及对核盘菌的拮抗效果。结果表明:CanS-34A对供试的16种真菌均有抑菌作用,且对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、三叶草核盘菌(S.trifoliorum)、小核盘菌(S.minor)的抑菌率显著高于其他供试菌;3种供试的细菌没有被抑制,且均属于G^-。CanS-34A在PDB中发酵6d,发酵滤液pH上升至7.3,抑菌效果达到最高。培养基中2%(V/V)的发酵滤液对核盘菌的抑菌率达60%。在离体及活体油菜叶片表面涂抹CanS-34A发酵滤液均能有效抑制核盘菌的生长,可有效防治油菜菌核病,表明黄柄曲霉CanS-34A可作为油菜菌核病的生防菌株资源。

改良小培养技术在黄柄曲霉形态学观察中的应用

目的探讨改良小培养技术在黄柄曲霉形态学观察中的价值。方法在特制玻片内部凹陷处注入25μL PDA培养基,待其冷却后接种黄柄曲霉,然后将玻片置于湿盒中25℃培养。连续观察培养过程中黄柄曲霉的形态学变化,以图片记录黄柄曲霉的形态学特征,必要时可进行乳酸酚棉兰染色,终止真菌培养。结果采用改良小培养技术培养后,可清楚地观察到黄柄曲霉生长过程中的形态学变化,菌体结构清晰、典型、完整,菌丝中部分颗粒状物质的流动也清晰可见。结论采用改良小培养技术可以清晰地观察到黄柄曲霉的微观结构特征,改良小培养方法是较好的真菌形态学研究技术。

珊瑚共附生黄柄曲霉次级代谢产物研究

目的研究东沙短足软珊瑚(Cladiella sp.)来源的黄柄曲霉菌(Aspergillus flavipes)中的活性次级代谢产物。方法采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备HPLC等分离手段对真菌发酵液乙酸乙酯提取物进行分离,运用现代波谱技术结合文献报道数据,对化合物的结构进行鉴定;采用核因子κB受体活化因子配基(RANKL)诱导小鼠骨髓单核巨噬细胞(bone marrow macrophage cells,BMMs)分化为成熟的破骨细胞,经抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)特异性染色,对化合物抑制破骨细胞分化活性进行研究。结果从该株真菌中分离得到4个细胞松弛素类化合物,其结构鉴定为trichalasins H,aspergilluchalasin,aspochalasin I和aspochalasin D。体外活性测试结果显示,化合物3和4可不同程度抑制BMMs向破骨细胞分化。结论对化合物3和4抑制破骨细胞分化活性的报告是本文首次报道,对新型抗骨质疏松活性物质研究具有科学价值。

抗真菌抗生素179M产生菌的分离鉴定和生理特性研究

从大亚湾海底沉积物中分离出一株具广谱抗真菌作用的曲霉（编号为179），经初步鉴定为黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)，该曲霉最适生长温度为36℃，最适生长pH为6。其抗真菌代谢产物179M对酵母类真菌的最小抑菌浓度为0.78-12.5μg/mL,对皮肤感染真菌石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)的最小抑菌浓度为1.56μg/mL，179M还能抑制多种植物病原真菌的生长。

一株抗辣椒疫病真菌的筛选及鉴定

从56份辣椒连作土壤中分离微生物782株,采用平板对峙法筛选出5株对辣椒疫病菌具有明显抑制作用的菌株,其中ASD菌株平板对峙试验结果表现最好,抑菌带宽11.7 mm,盆栽防效为75.12%,优于化学药剂代森锰锌和烯酰吗啉,有较好的应用开发前景。ASD菌株分生孢子头初为辐射形,后期为柱形;产孢结构双层,有明显的瓶梗及多育现象;分生孢子球形或近球形、壁滑,未见壳细胞;其rDNA-ITS序列与GenBank中已知序列比对,相似度97%,确定该菌株为黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)。

12种海洋真菌发酵液粗多糖抗流感病毒(H1N1)活性研究

目的从红树林来源的黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)及绮丽穗霉(Spicaria elegans KLA03)的6种培养基发酵液中获得12种粗多糖并评价其抗流感病毒(H1N1)活性。方法运用高效液相色谱(HPLC),红外光谱(IR)等对各粗多糖的单糖组成和基本结构特征进行分析比较;采用犬肾(MDCK)细胞模型结合细胞病变效应(CPE)实验对其体外抗H1N1活性进行评价。结果所有粗多糖均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖,某些多糖还含有氨基葡萄糖、氨基半乳糖或少量木糖与阿拉伯糖;在250μg/mL的浓度下,各多糖呈现了不同的抗H1N1病毒活性,其中AF-3及SEK-4对H1N1抑制率分别达到为69.6%和67.5%。结论通过改变生长条件,从海洋真菌发酵液中得到了2种具有较强抑制H1N1活性的胞外多糖。