异黄柏酮酸对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用

目的探讨异黄柏酮酸对脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)炎症的作用及机制。方法采用CCK-8法检测异黄柏酮酸对RAW264.7细胞活性的影响,Griess法及荧光法测定一氧化氮(NO)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、前列腺素E 2(PGE 2)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平,免疫荧光法检测NF-κB p65核转位,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)和NF-κB、MAPK信号通路相关蛋白表达。结果异黄柏酮酸能降低LPS刺激RAW264.7细胞释放的NO水平(P<0.05),其IC_(50)为(39.6±3.05)μmol/L;同时,异黄柏酮酸降低了炎性介质PGE 2、TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1水平(P<0.05),且在0~200μmol/L浓度条件下对RAW264.7细胞活性无明显影响(P>0.05)。进一步研究表明,异黄柏酮酸可降低iNOS、COX-2蛋白表达,抑制IκBα蛋白降解和p65蛋白核转位,下调p38和ERK磷酸化蛋白表达(P<0.05)。结论异黄柏酮酸具有一定的抗炎作用,其机制与抑制MAPK/NF-κB信号通路有关。

白鲜皮主要药效成分白鲜碱、黄柏酮、梣酮的抗皮炎作用比较及机制研究

目的:比较中药白鲜皮的3种主要活性成分白鲜碱、黄柏酮、梣酮在特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)治疗中的作用并探讨其机制。方法:利用2,4⁃二硝基氟苯(2,4⁃dinitrofluorobenzene,DNFB)构建小鼠皮炎模型,观察白鲜皮醇提物、白鲜碱、黄柏酮、梣酮、地塞米松对AD小鼠引起的慢性瘙痒的作用;采用皮损评分评估小鼠皮损严重程度。苏木精⁃伊红(hematoxy⁃lin⁃eosin,HE)和甲苯胺蓝染色评估小鼠表皮厚度和肥大细胞数目。酶联免疫吸附试验(enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠皮损组织中白介素(interleukin,IL)⁃4、IL⁃31、IL⁃10水平;Western blot检测Janus激酶(janus kinase,JAK)1、p⁃JAK1、信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3、p⁃STAT3、STAT6、p⁃STAT6的蛋白水平。结果:AD小鼠引起的慢性瘙痒能明显被白鲜皮醇提物抑制。与模型组相比,白鲜皮的3种主要活性成分中:白鲜碱和梣酮能明显抑制AD小鼠引起的慢性瘙痒,改善皮损症状和炎症细胞浸润,下调IL⁃4、IL⁃31水平,上调IL⁃10水平,并抑制JAK1⁃STAT3/STAT6信号通路,但黄柏酮组与模型组比较差异无统计学意义。结论:白鲜碱和梣酮可能是白鲜皮发挥抗皮炎作用的主要活性成分。

高效液相色谱法测定关黄柏叶中黄柏酮的含量

目的:采用高效液相色谱法建立关黄柏叶中黄柏酮的含量测定方法。方法:高效液相色谱法,WondaSil C18 Superb色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-0.1%醋酸水(V∶V=49∶51)为流动相,流速为1.0 mL/min,检测波长为215 nm,柱温为30℃。结果:黄柏酮在1.68~52.74μg/mL范围内,线性关系良好(R2=0.9999)。供试品溶液在24 h内稳定性良好,方法的精密度高,平均加样回收率为102.2%,RSD为2.27%。关黄柏叶中黄柏酮的含量为1.604 mg/g。结论:所建立的方法可用于测定关黄柏叶中黄柏酮的含量。

黄柏酮对单侧输尿管梗阻模型小鼠肾间质纤维化及铁死亡的影响

目的研究黄柏酮对单侧输尿管梗阻(UUO)模型小鼠肾间质纤维化的改善作用,并基于核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路介导的铁死亡探讨其作用机制。方法将30只小鼠随机分为假手术组、模型组、厄贝沙坦组(阳性对照,20 mg/kg)和黄柏酮低、高剂量组(10、40 mg/kg),每组6只。除假手术组外,其余各组小鼠均通过结扎单侧输尿管建立UUO模型。术后,给药组小鼠腹腔注射相应药物,假手术组、模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,每天1次,连续7 d。检测小鼠血清中肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)水平,丙二醛(MDA)含量,总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和肾脏组织中Fe^(2+)浓度;苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察小鼠肾脏组织形态和纤维化情况;免疫组化法检测小鼠肾脏组织中纤连蛋白(Fn)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、GPx4、Nrf2的表达,Western blot法和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测小鼠肾脏组织中Fn、α-SMA、Nrf2、GPx4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白及mRNA的表达水平。结果与假手术组比较,模型组小鼠血清中Cr、BUN水平,MDA含量,肾脏组织中Fe^(2+)浓度以及Fn、α-SMA蛋白和mRNA的表达水平均显著升高(P<0.05);血清中T-SOD活力,肾脏组织中Nrf2、GPx4、SLC7A11蛋白和mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05);肾脏组织中肾小管扩张,胶原沉积明显,纤维条索较粗且着色较深,肾间质炎症细胞浸润明显。经黄柏酮干预后,小鼠血清或肾脏组织中上述指标(黄柏酮低剂量组SLC7A11 mRNA除外)水平均显著逆转(P<0.05),肾脏组织病理损伤、胶原沉积均有所减轻。结论黄柏酮可改善UUO模型小鼠的肾间质纤维化,具体作用机制可能与激活Nrf2/GPx4信号通路、抑制铁死亡有关。

HPLC法测定两种黄柏及其炮制品中黄柏内酯和黄柏酮

目的建立同时测定黄柏及其炮制品中黄柏内酯和黄柏酮的高效液相色谱方法。方法以Agilent C18为分析色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-水-磷酸(45∶55∶0.2)为流动相,检测波长为205 nm,柱温为35℃,体积流量:1.0mL/min作为色谱条件。结果黄柏内酯和黄柏酮分离良好,线性范围依次为0.720～14.40μg、0.0524～1.048μg;平均加样回收率(n=6)依次为100.2%和99.9%;RSD分别为1.7%、1.9%;关黄柏和川黄柏经炮制后,黄柏内酯及黄柏酮的量均有所下降。结论该方法准确,操作较为简便易行,精密度及重复性良好,可用于黄柏及其炮制品中黄柏内酯和黄柏酮的质量控制。

从白鲜皮中同时制备梣酮、白鲜碱、黄柏酮单体的方法

以HPLC测定计算的梣酮、白鲜碱、黄柏酮3种单体的总单体得率为指标,探讨了提取溶媒、提取方式、提取时间、液料比和提取次数对提取效果的影响,并运用正交试验对提取工艺进行优选;提取得到的浸膏进行一次硅胶柱层析和重结晶即分离纯化出3种单体;单体经波谱方法进行结构鉴定,经TLC和HPLC进行纯度检查和含量测定。结果显示,最佳的提取工艺为加入药材重量6倍的乙酸乙酯回流提取3次,每次1 h;分离纯化后的3种单体纯度高,用其作为对照品对白鲜皮药材进行含量测定结果满意。实验表明提取工艺及分离方法能同时制备3种单体,方法简单快速,单体的纯度和回收率高。

不同生长阶段白鲜皮中黄柏酮和梣酮累积量的变化规律

连续2 a采集白鲜皮样品,采用加热回流法提取白鲜皮中的黄柏酮和梣酮,通过高效液相色谱法测定其质量分数。结果表明:白鲜皮中黄柏酮和梣酮累积量,均与生长年限呈正相关,同一种成分的年变化基本相同。黄柏酮与梣酮的年变化规律差异较大,2种成分在一个生育期的不同生长阶段,积累量差异显著;果期的黄柏酮和花期的梣酮累积量最大。白鲜春季或秋季采收均可,3年生以上的适宜采收。

白鲜营养器官黄柏酮和梣酮的组化定位及含量的动态变化

采用组织化学和高效液相色谱法(HPLC法)对秦岭产药用植物白鲜(Dictamnus dasycarpus)营养器官白鲜皮(根皮)、木质部、茎和叶中萜类物质的组织定位及黄柏酮和梣酮含量的动态变化规律进行了研究。组织化学测试结果表明:在根中,萜类物质主要分布在多年生根的周皮、次生韧皮部、韧皮部的油细胞、维管形成层以及木质部的薄壁组织中;在茎中,萜类物质主要分布在茎的表皮、紧贴表皮的分泌囊、皮层、韧皮部和木质部的薄壁细胞、髓部以及紧贴茎表皮的分泌囊中;在叶中,萜类物质主要分布在叶的表皮、头状腺毛、栅栏组织、海绵组织及维管束位置的薄壁组织中。HPLC测试结果表明:白鲜植物体除药用部位白鲜皮外,在木质部、茎和叶中均含有萜类物质黄柏酮和梣酮;试验测试样本白鲜皮中黄柏酮和梣酮的含量均符合药典标准(2015);在除营养生长期外几个生长阶段的木质部以及盛花期、成熟前期和成熟期I的茎和叶中,其黄柏酮含量亦均符合药典标准,其中盛花期白鲜茎和叶中黄柏酮的含量为药典最低含量标准的2~4倍多。秦岭终南山产白鲜皮品质优良,白鲜的根木质部、茎和叶用来提取黄柏酮,具有较好的应用价值,建议实践中针对不同需求综合利用白鲜非药材部位。

HPLC法同时测定白鲜皮中白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量

目的：建立RP-HPLC同时测定白鲜皮中白鲜碱、黄柏酮和腀酮含量的方法。方法：采用RP-HPLC,70%乙醇超声提取,色谱条件：色谱柱AlltimaC18（4.6mm×250mm,5μm）,保护柱All-GuardTM C18（4.6mm×7.5mm,5μm）,流动相乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,流速1.0mL/min,进样量10μL,柱温25℃,检测波长238nm。结果：该3种成分分离良好,线性范围依次为0.4～16.0,10～400和1.6～64.0mg/L,加样回收率分别为99.95%,98.91%,100.02%,RSD分别为：1.81%,1.83%,2.62%。结论：本方法简单、快捷,重现性好,准确率高,可用于白鲜皮药材的质量控制。

HPLC法同时测定白鲜皮配方颗粒中白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量

目的:建立同时测定白鲜皮配方颗粒中白鲜碱、黄柏酮和梣酮含量的方法。方法:色谱柱为Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(55:45),流速为1.0 m L·min-1,检测波长为236 nm,柱温为室温,自动进样器进样,进样量10μL。结果:白鲜碱在2.505-40.08μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 7,n=5),平均回收率为99.04%(RSD=1.51%,n=6);黄柏酮在26.12-418.0μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 8,n=5),平均回收率为99.48%(RSD=2.25%,n=6);梣酮在7.540-120.6μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 8,n=5),平均回收率为99.54%(RSD=2.09%,n=6)。结论:本法操作方便,结果准确,精密度好,专属性强,可用于白鲜皮配方颗粒的质量控制。

市售白鲜皮黄柏酮和梣酮含量分析

目的测定市售白鲜皮中黄柏酮、梣酮的含量,评价目前该饮片市场规范情况。方法以白鲜皮中黄柏酮和梣酮的含量为评价指标,以C18为固定相,色谱乙腈-0.2%磷酸水（45∶55）为流动相,检测波长为228 nm,流速为0.8 mL·min-1,柱温为室温,采用HPLC法测定白鲜皮中黄柏酮和梣酮的含量。结果黄柏酮、梣酮含量分别在0.24%~1.46%和0.02%~0.11%之间,梣酮和黄柏酮的达标率分别为62.5%,100%。结论咸阳市场上62.5%的药店出售的白鲜皮达到2010版《中国药典》标准。

关黄柏不同炮制品中黄柏酮与黄柏内酯的含量测定

目的:以黄柏酮、黄柏内酯含量为指标,考察不同炮制方法对关黄柏中柠檬苦素类成分含量的影响。方法:采用RP-HPLC测定关黄柏不同炮制品中黄柏酮、黄柏内酯的含量,色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(50∶50),流速1.0 mL/min,柱温25℃,检测波长205 nm。结果:关黄柏不同炮制品中黄柏酮、黄柏内酯的含量有显著差异,黄柏酮的含量变化依次为:生品>炒炭品>酒炙品≈盐炙品,黄柏内酯的含量变化依次为:炒炭品≈酒炙品≈盐炙品>生品。结论:炙法使黄柏酮损失量远大于炒炭法损失量,炙法和炒炭均使黄柏内酯有近似程度的增加,增加率依次为18.15%、15.62%、15.84%。

不同产地白鲜皮中黄柏酮含量测定及聚类分析

目的测定不同产地白鲜皮中黄柏酮含量并进行聚类分析.方法采用HPLC法测定不同产地白鲜皮中黄柏酮含量,色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm);流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长:黄柏酮215nm;柱温:40℃;流速:1mL.min-1;进样量:10μL;记录时间:20min.然后采用计算机的模式识别方法进行聚类分析.结果不同产地白鲜皮药材中黄柏酮的含量分别为:辽宁0.151 6%,内蒙古0.234 8%,黑龙江0.149 9%,吉林0.150 8%,河北0.194 6%,陕西0.159 8%,山东0.162 1%,安徽0.210 2%.范围为1.499～2.348mg/g.结论不同产地白鲜皮中黄柏酮含量不尽相同、东北部地区大致可归为一类.

黄柏酮对肺癌细胞核糖体合成、增殖的影响及机制

目的探讨黄柏酮对非小细胞肺癌细胞(A549细胞)增殖的影响及潜在的作用机制。方法常规培养A549细胞,将对数生长期A549细胞随机分为对照组、黄柏酮组,分别加入DMSO溶剂、50μmol/L黄柏酮继续培养。用尿嘧啶核苷类似物(EU)标记法检测细胞核糖体RNA(rRNA)合成,用胸腺嘧啶核苷类似物(EdU)标记法检测细胞增殖能力,用实时荧光定量PCR检测细胞中rRNA(5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、45S pre-rRNA)表达,用West‑ern blotting法检测细胞中磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化的S6核糖体蛋白235/236[p-RPS6(235/236)]、p-RPS6(240/244)蛋白表达。结果黄柏酮组荧光信号强度与对照组荧光信号强度的比值为0.684±0.008(P<0.05)。与对照组比较,黄柏桐组EdU阳性细胞率低,5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、前体45S rRNA相对表达量低,p-mTOR、p-RPS6(235/236)、p-RPS6(240/244)蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论黄柏酮可抑制肺癌细胞核糖体合成及增殖,其作用机制可能与抑制mTOR/RPS6信号通路激活有关。

黄柏酮对大鼠自体移植静脉桥术后内膜增生的抑制作用及其机制

目的探讨黄柏酮对大鼠自体移植静脉桥术后内膜增生的抑制作用及其可能作用机制。方法选取42只雄性SD大鼠,构建自体静脉移植模型后将其随机分为实验组和对照组,每组21只,实验组给予黄柏酮15 mg/(kg·d)腹腔注射,对照组注射等量生理盐水,在术后0、2、4周分别取移植术后的大鼠静脉桥,观察大鼠静脉桥组织形态,测量新生内膜厚度,检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平和蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平。结果术后2周和4周时,对照组平滑肌细胞大量增殖,内皮细胞排列欠规则,实验组移植静脉桥平滑肌细胞增殖少于对照组;实验组静脉桥新生内膜厚度薄于对照组(P<0.05),PCNA蛋白表达水平和Akt磷酸化水平低于对照组(P<0.05)。结论黄柏酮可能通过降低Akt磷酸化水平来抑制平滑肌细胞增殖,从而减轻静脉桥内膜增生。

黄柏酮通过影响线粒体功能抑制肾上腺皮质瘤细胞皮质酮合成的研究

目的研究黄柏酮对肾上腺皮质激素合成与分泌的影响。方法体外培养Y1小鼠肾上腺皮质瘤细胞,采用2.5~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,运用MTT法检测细胞活性;以80μmol/L黄柏酮处理细胞24 h后采用流式细胞术检测细胞周期,共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜变化;以ELISA法检测细胞分泌液皮质酮含量;以40~160μmol/L黄柏酮干预细胞24 h,80μmol/L黄柏酮干预细胞24~48 h,运用qPCR法检测皮质酮合成酶mRNA表达,Western blot检测其蛋白表达。结果与对照组比较,2.5~40μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率约为35%(P<0.05),160μmol/L黄柏酮对细胞的抑制率为60%以上(P<0.01)。黄柏酮导致G1期细胞显著增加并促进线粒体膜亮度增强(P<0.05),同时显著抑制线粒体膜Mfn1、Mfn2蛋白表达以及皮质酮分泌(P<0.05)。进而发现,40~160μmol/L黄柏酮显著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表达(P<0.01),160μmol/L黄柏酮显著增强Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表达(P<0.01);80μmol/L黄柏酮持续给药48 h内,均显著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表达(P<0.01),并抑制StAR、CYP11A1蛋白表达,然而促进Star基因表达(P<0.01)。结论黄柏酮抑制肾上腺皮质细胞皮质酮合成过程,可能与其阻滞细胞周期及影响线粒体膜上类固醇激素合成酶表达有关。

HPLC测定不同来源白鲜皮中黄柏酮含量

目的:研究不同地区白鲜皮药材及饮片中黄柏酮的含量。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为AgilentC18(150nm×4.6nm,5μm),流动相为甲醇-水(60∶40);检测波长212nm。结果:加样回收率为96.71%;RSD为1.56%;相关系数r=0.9999;不同地区的白鲜皮药材与白鲜皮饮片中,黄柏酮的含量范围为2.41～3.01mg/g。结论:不同地区白鲜皮药材与相应饮片中,黄柏酮含量基本相同。

HPLC法测定丹龙止痒胶囊中黄柏酮的含量

目的建立以HPLC法测定丹龙止痒胶囊中黄柏酮含量的方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱Agilent Hypersil(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-2g.L-1磷酸(44∶56);检测波长为220nm;柱温为30℃,进样量20μL。结果黄柏酮在4.072～162.88μg.mL-1(r=0.999 98)范围内呈良好线性关系;回收率为99.5%;RSD为1.8%(n=6)。结论该方法重复性好、灵敏度高、定量准确,可用于丹龙止痒胶囊的质量控制。

白鲜皮中黄柏酮标准样品的研制

依据GB/T 15000.3-2008标准样品的工作导则,研制黄柏酮标准样品。以白鲜皮为原料,硅胶柱色谱结合重结晶的方法制备黄柏酮单体,通过UV、IR、MS和NMR等技术进行结构表征,同时进行了薄层色谱鉴别和热重分析,通过HPLC检测分析技术,进行了均匀性检验、稳定性检验和8家实验室联合定值。结果表明,该样品均匀性良好,在0~4℃储存24个月稳定性良好,定值结果确定其标准值为98.94%,置信度95%的不确定度为0.12%。说明,黄柏酮标准样品达到了GB/T 15000.3-2008规定的技术要求,具有溯源性,可用于黄柏酮及相关产品的质量控制和检测方法评定。

高效液相色谱法同时测定肤白胶囊中梣酮和黄柏酮的含量

目的建立高效液相色谱法同时测定肤白胶囊中梣酮和黄柏酮的含量。方法色谱柱为Waters Sunfire C18(250 mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-水(65∶35);检测波长为236nm;流速为1.0mL·min^(-1);柱温为30℃。结果梣酮进样量在7.19~43.15μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为98.88%,RSD为1.0%;黄柏酮进样量在6.94~41.66μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为98.62%,RSD为1.2%。结论该方法准确、快速、稳定、方便,可以作为肤白胶囊中梣酮和黄柏酮的含量测定方法。