苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析

为提高黄酮代谢途径中的关键酶活性,增加苦荞黄酮类化合物的合成量,根据已知植物的F3H基因同源序列,采用RT-PCR和RACE结合的方法,克隆了苦荞黄酮代谢途径中关键酶基因F3H,命名为FtF3H(GenBank登录号:FJ456858)。序列分析结果表明,FtF3H基因长1369bp,编码367个氨基酸,该氨基酸序列及其cDNA序列与葡萄、牵牛F3H等的同源性约80%。二级结构预测表明,随机卷曲是FtF3H蛋白最大量的结构元件,而α-螺旋和β-片层则散布于整个蛋白质中;三维结构建模预测FtF3H蛋白具有铁离子结合位点及2-O-酮戊二酸结合位点等F3H蛋白典型结构。

芜菁黄烷酮3-羟化酶基因的克隆、序列分析及表达

花青素是一类重要的植物次生代谢产物,黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成早期阶段的重要催化酶。利用UV-A处理津田芜菁(Tsuda turnip)和赤丸芜菁(Yurugi Akamaru turnip)块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆了BrF3H基因。津田芜菁和赤丸芜菁的F3H基因完全相同。BrF3H的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3H与甘蓝型油菜(Brassica napus)F3H-1的同源性为99%。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3H表达,基因的表达量与处理时间呈相关。

紫色甘薯渝紫薯7号黄烷酮3-羟化酶基因的克隆和序列分析

为渝紫薯7号品种后续的遗传转化及其分子育种提供理论基础,采用同源克隆和RACE方法对其生物合成途径中关键酶基因进行同源性克隆及生物信息学分析。结果表明:从渝紫薯7号中克隆到F3H基因的全长c DNA序列(Genbank登录号为KU144881),序列全长为1280 bp,包括5’端UTR+一个编码368个氨基酸残基的编码区+3’端UTR+poly A尾巴;F3H基因蛋白具有结合酮戊二酸的RXS基序Arg287-Ser285和结合亚铁离子的保守氨基酸His219、Aps221和His277,结构域位于蛋白的核心(Fe2+被包埋在酶的中心);在Gen Bank中,渝紫薯7号F3H的序列与圆叶牵牛的F3H序列之间具有很高的相似性,为96%;渝紫薯7号F3H蛋白与近缘物种茑萝氨基酸相似性较高,为94%;渝紫薯7号F3H符合植物中普遍存在的F3H基因,同时具有生物学活性。

花生黄烷酮3-羟化酶基因AhF3H的克隆和表达分析

利用花生转录组测序结果和GenBank EST数据库,首次从花生中克隆了黄烷酮3-羟化酶基因,命名为AhF3H,GenBank登录号为KF312218。氨基酸序列分析表明,AhF3H与其他植物F3H有较高的同源性。进化树分析表明,AhF3H与大豆、野生大豆F3H的亲缘关系较近。在花生紫色种质材料及丰花1号中,AhF3H的相对表达水平同花青素含量呈正相关,表明AhF3H在花生花青素合成代谢过程中具有重要作用。

核桃黄烷酮3-羟化酶基因cDNA 3′端的克隆与序列分析(英文)

从核桃(Juglans regia)中首次克隆得到黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA片段,并命名为JrF3H,Gen-Bank登录号为FJ966204。JrF3H长1 029 bp ,编码342个氨基酸。蛋白质序列多重比对结果表明,推导的JrF3H蛋白质与其他植物F3 H蛋白质具有很高的相似性,JrF3H蛋白质与茶学、拟南芥、大豆、烟草、小麦和银杏F3 H蛋白质序列的同源性分别为86 %、85 %、85 %、82 %、80 %和79 %。此外,JrF3H在相似的位置存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点。F3 H系统进化树表明,JrF3H与乔木类植物的F3 H基因聚类关系最近。JrF3H基因的克隆将有助于弄清该基因在核桃黄酮代谢途径中所起的作用。

白菜黄烷酮-3-羟化酶基因的电子克隆与序列分析

现根据同源基因相对保守性,利用已知的油菜F3H基因序列,采用电子克隆的方法获得了白菜F3H基因的cDNA序列;并采用生物信息工具对白菜F3H的性质包括氨基酸序列组成,物理和化学性质,疏水性或亲水性,二级和三级结构的特点进行了研究。结果表明:白菜F3H基因cDNA全长为1 228bp,包含1个完整的开放读码框(1 077bp),编码358个氨基酸。其分子量为40 104.6Da,等电点为5.45;其三维结构显示其是具有7个螺旋和12个折叠和一些不规则卷曲组成的球状结构。

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是参与黄酮类化合物合成过程的一个关键酶。为了研究青蒿中F3H对青蒿素的影响,从青蒿中克隆到黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H),全长为1 095 bp,编码364个氨基酸。Southern Blot证实AaF3H基因在青蒿基因组中只有1个拷贝。通过构建AaF3H过表达载体并稳定转化青蒿来获得转基因株系,再采用HPLC测定过量表达AaF3H的转基因青蒿植株中的青蒿素含量。结果表明,过表达AaF3H转基因青蒿植株中青蒿素的含量显著升高。通过实时荧光定量PCR分析,在转基因青蒿中,作为青蒿素合成的关键酶,紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因(AaADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因(AaCYP71AV1)和青蒿醛Δ11(13)双键还原酶基因(AaDBR2)的表达量显著提高。研究结果表明过量表达AaF3H基因是提高青蒿中青蒿素含量的有效方法。

海岛棉黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因序列分析和表达

根据棉纤维发育相关基因转录组学、表达谱分析结果,从海岛棉(新海21)中筛选到一个与棉纤维发育相关的黄烷酮3-羟化酶基因(Gb F3H)。生物信息学分析表明,该基因编码区长1107bp,编码368个氨基酸,多序列比对发现Gb F3H序列保守性较高,具有典型的2-酮戊二酸双加氧酶结构域。实时定量PCR分析表明,Gb F3H基因在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后5 d的胚珠中表达量最高,推测Gb F3H基因可能对棉纤维发育具有重要作用。

汉中黑稻黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)的遗传变异分析

本实验通过PCR和测序拼接获得汉中地区8个黑稻品种黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)编码区序列,在NCBI中用BLAST分析首次发现该基因位于水稻4号染色体。发现8种黑稻和普通籼稻F3H序列完全相同,与粳稻相比较,则存在4个突变位点,导致2个氨基酸突变。基于F3H序列信息的进化树表明黑稻与籼稻、粳稻、小麦、玉米的亲缘关系较近;遗传距离和同源性分析表明F3H基因较为保守,是一个古老的基因,可用于种属的鉴定分析。F3H蛋白理化性质分析发现,黑稻与其它禾本科植物存在一定差异,蛋白三维结构及相关位点预测发现粳稻和黑稻无明显差异,初步认为黑稻F3H序列变异可能与花青素的合成无关,需要在其表当量与花青苷和成合成与沉积的关系方面开展进一步研究。

山葡萄黄烷酮3-羟化酶VamF3H基因及其克隆

采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法,从山葡萄果皮中克隆到黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的c DNA全长序列。该基因全长1 398 bp,包含1 092 bp的完整开放阅读框,编码363个氨基酸,相对分子质量为40.81 ku,等电点(PI)值为5.37。二级结构预测表明,随机卷曲是Vam F3H蛋白最大量的结构元件,不具有信号肽,属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列与欧亚种葡萄(FQ389950)、圆叶葡萄(KF040970)、美国蔓藤(JX087441)等的F3H类基因同源性较高,相似性分别为99%、99%、96%。

黄烷酮3-羟化酶基因表达分析及转基因大豆新种质创制

黄烷酮3-羟化酶（F3H）是大豆异黄酮代谢途径重要酶类。研究F3H在不同大豆品种中的表达差异,并应用转基因途径创制新种质是提高大豆异黄酮含量的重要途径。以高异黄酮含量大豆品种中豆27和低异黄酮含量大豆品种楚秀为试材,采用q PCR技术,分析F3H在大豆不同发育时期、组织部位中的表达差异;并利用花粉管通道转化技术,获得转F3H阳性植株。结果表明：F3H在2个大豆品种R1~R7期叶片中的表达模式不同,中豆27的F3H表达量在R1期最高,而后开始下降,R2~R5期维持较低水平,R6期略有上升,R7期又出现下降;楚秀F3H表达量在R1~R4期较低,R5期出现表达高峰,R6期开始下降。F3H在2个大豆品种R5~R8期籽粒中的表达模式基本相同,表达量均从R5期开始下降,且R6~R8期维持较低水平。基于此,构建F3H RNAi反义载体,并利用花粉管通道技术转入不同大豆品种,获得了5个转基因新材料。

百合黄烷酮3-羟化酶基因LhSorF3H的克隆与表达

为了探究百合花色的调控机制,以东方百合品种‘索邦’(Sorbonne)的花蕾为试验材料,根据前期转录组测序结果,成功克隆出黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因的编码序列和基因组序列,其中,编码序列全长1 110bp,可编码369个氨基酸;基因组序列全长1 438bp,包含3个外显子和2个内含子,命名该基因为LhSorF3 H(GenBank登录号为MF614135)。生物信息学分析结果显示,黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。LhSorF3 H编码的蛋白与郁金香(Tulipafosteriana)最为相似。半定量RT-PCR结果显示,LhSorF3H在花被、柱头以及花柱中表达明显,在花丝、子房、嫩茎、茎生根及上部叶片中表达较弱,而在花药和中下部叶片中基本不表达。LhSorF3 H在不同发育阶段的花被片中均有表达(S2和S6阶段除外);黑暗处理使LhSorF3 H表达降低,黑暗处理2h的LhSorF3 H表达量降到最低,之后表达量开始上升;转入光照条件后,LhSorF3H的表达水平持续增加。研究表明,LhSorF3 H基因对昼夜节律和光照具有双重响应的特性。

桑树黄烷酮-3-羟化酶基因的克隆及在35份桑种质资源植株叶片中的表达差异

黄烷酮-3-羟化酶（F3H）是黄酮类化合物合成途径的关键酶之一,其催化黄烷酮合成的二氢黄酮醇又可经不同代谢途径合成花青素等多种黄酮类物质。以鲁桑（Morus multicaulis）品种育711号植株的幼叶cD NA为模板,利用RT-PCR和RACE技术克隆了桑树F3H基因cD NA的全长序列,将该基因命名为MmF 3H（GenB ank登录号：KU301748）。该基因开放阅读框（ORF）长1 095 bp,编码一个含有365个氨基酸残基的多肽,预测蛋白质分子质量为40.15 kD,等电点为4.93。该基因编码氨基酸序列与川桑（Morus notabilis）F3H的序列相似度高达98%,与其它5种植物F3H也具有较高的序列相似度（79%~82%）,说明F3H基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性;系统进化树也显示来自鲁桑的F3H序列与来自川桑的F3H序列聚在一枝,亲缘关系最近。qRT-PCR检测MmF 3H基因在35份桑种质资源植株幼叶中的表达水平存在较大差异,相对表达量较高的达到0.784 5,而较低的仅为0.012 1;用分光光度法测定35份桑种质资源植株桑叶片中的总黄酮和总花青素含量也存在较大差异,而且总黄酮含量的差异与MmF 3H基因表达水平的差异具有一定相关性,推测MmF 3H催化生成的产物属于黄酮类化合物合成途径的上游产物。

洋桔梗黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及其反义表达载体的构建

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是花青素生物合成途径中的关键酶,对花色的形成具有重要作用。以洋桔梗试管苗叶片基因组DNA为模板,通过设计分别带有酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ的1对特异引物,进行PCR扩增,克隆了洋桔梗F3H基因;对克隆得到的F3H基因进行测序鉴定,再将该基因反向插入pBI121质粒,成功构建了植物反义表达载体pBI121-F3H,为利用植物基因工程技术调控洋桔梗F3H基因的表达提供了重要基础。

三角梅黄烷酮3-羟化酶基因的克隆及表达分析

为探究三角梅产生飞燕草素的可能性,根据前期获得的三角梅转录组数据,克隆花青素合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶基因(flavanone 3-hydroxylase,F3H),并通过荧光定量PCR技术检测其在不同颜色三角梅叶片及苞片中的表达量差异。结果显示成功克隆获得了一条cDNA全长1 089 bp,编码363个氨基酸的基因序列,将其命名为BsF3H,登陆GeneBank(OL957093)。BsF3H相对分子质量为41.14 kD,理论等电点为5.48,含有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域,不具有信号肽及跨膜结构,细胞定位于细胞质中,最多的二级结构为α螺旋,三级结构预测显示为单体蛋白。RT-qPCR结果显示该基因在不同颜色三角梅中表达量均不高,相对而言在紫色安格斯(Elizabeth Angus)苞片中表达量最高。研究结果表明三角梅具有产生各类花青素的潜力,可利用基因工程手段对其颜色进行改造。

苦荞黄烷酮3-羟化酶基因FtF3H及其启动子的克隆与功能分析

【目的】克隆苦荞FtF3H基因及其启动子序列,探究该基因的生物学效应及启动子对环境因素与激素的响应。【方法】基于苦荞基因组和转录组数据克隆FtF3H基因及其启动子,对二者进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术检测FtF3H对MeJA、ABA和光处理的响应,进一步利用转基因拟南芥技术,分析FtF3H的过表达对黄酮合成的影响。【结果】苦荞FtF3H基因DNA序列长2034 bp,包括2个内含子和3个外显子;其ORF序列为1104 bp,推导的FtF3H蛋白含367个氨基酸残基,归类于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族且具有典型的植物F3H的分子特征。启动子PFtF3H在核心启动子基序外,还含有数目众多的光应答元件和激素响应元件,qRT-PCR检测结果显示,PFtF3H可强烈响应ABA、MeJA和光照的诱导。转基因拟南芥中,FtF3H的过表达可引起总黄酮含量显著增加(P<0.05),黄酮合成相关酶基因,AtANS、AtDFR和AtF′3H等的表达量显著上调(P<0.05),而拟南芥内源的AtF3H表达受到抑制(P<0.05)。【结论】苦荞FtF3H基因是一个典型的植物黄烷酮3-羟化酶,其表达受到激素和光的调控,在拟南芥中的过表达可促进黄酮的合成和积累。

甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。本研究基于前期转录组数据,以‘福菜薯7-6’叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H,利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预测其跨膜结构和亚细胞定位,并利用qRT-PCR分析盐旱胁迫处理下基因的表达特性。结果表明,该基因含有3个外显子和2个内含子,编码368个氨基酸,蛋白分子量为41.12 kDa,等电点为5.83。存在多种类型的启动子顺式作用元件,如光响应元件G-Box、ACE,干旱胁迫相关的MBS元件,与脱落酸激素响应相关的ABRE元件等。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上,可见IbF3H的编码区高度保守,且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域(DIOX-N superfamily)和典型的F3H蛋白功能结构域(2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域),属于双加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在细胞质中表达并且不具备跨膜结构。qRT-PCR研究结果表明,IbF3H基因并非组织特异性表达的基因,叶和茎表达量高于茎尖和根。模拟盐胁迫处理后,IbF3H基因表达量呈现先下降后上升的趋势;模拟干旱胁迫处理后,IbF3H基因表达量始终高于对照组,以响应逆境胁迫。本研究可为下一步探索IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能作用奠定基础。

芜菁的类黄酮3'羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性

用UV-A处理‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁块根24h后提取总RNA,以RT-PCR方法分别克隆到BrF3'H1和BrF3'H2基因。BrF3'H1和BrF3'H2的开放读码框为1536bp,均编码511个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3'H1和BrF3'H2与甘蓝型油菜F3'H的同源性达99%,在第45～476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域。BrF3'H1和BrF3'H2基因有高度同源性,核苷酸序列的17个位点处有差异,推导的氨基酸序列在5个位点处有差异。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3'H1表达,基因的表达量与UV-A处理时间呈相关,UV-A不能诱导BrF3'H2基因表达。

紫茎泽兰类黄酮3′-羟化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

用基因特异引物对紫茎泽兰F3'H基因进行PCR扩增、T-A克隆及测序,采用DNAMAN 5.0和MEGA 3.0等生物信息学软件进行序列分析,并对F3'H基因的组织表达特性及原核表达产物进行了分析。结果表明紫茎泽兰F3'H基因cDNA全长为1722 bp(GeneBank登录号EF137714),编码570个氨基酸,与翠菊、大豆和非洲菊F3'H基因的氨基酸序列同源性分别为64.4%,57.3%和54.5%。Southe(?)杂交表明该基因为单拷贝。Northe(?)杂交表明F3'H基因在紫茎泽兰叶中表达量最高,且其表达受泽兰酮诱导。SDS-PAGE电泳表明F3'H基因经IPTG诱导后在大肠杆菌中能表达56.8 kDa的目的蛋白。

芜菁类黄酮3'-羟化酶基因的功能鉴定及启动子初步分析

类黄酮3'-羟化酶(Flavonoid 3'-hydroxylase,F3'H)是细胞色素P450单加氧酶,在花青素合成途径中催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素,进而形成矢车菊色素。利用津田芜菁Br F3'H1和赤丸芜菁Br F3'H2基因构建过量表达载体后遗传转化烟草,转基因植株的花色加深。通过染色体步移法克隆了Br F3'H1和Br F3'H2基因上游846和851 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,Br F3'H1P和Br F3'H2P均包含TATA box、CAAT box、光调控元件、MRE、ABRE、ATGCAAAT-motif、ERE、O2-site、RY-element、LTR等多个顺式作用元件;二者的核苷酸序列在7个位点存在差异。利用Br F3'H1P和Br F3'H2P序列替换p CAMBIA1301植物表达载体的35S启动子后遗传转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,Br F3'H1P和Br F3'H2P序列均能驱动GUS基因表达。通过PCR方法获得了Br F3'H1P和Br F3'H2P的一系列缺失片段,融合GUS基因后转化烟草。染色结果显示,Br F3'H1P和Br F3'H2P系列缺失片段均具有起始GUS基因表达的活性。Br F3'H1和Br F3'H2基因的功能鉴定及启动子的初步分析将为揭示津田芜菁和赤丸芜菁F3'H基因的光诱导表达调控机理奠定研究基础。