黄瓜绿斑驳病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析及其分组

为了揭示黄瓜绿斑驳病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）河北分离物分子变异及系统进化情况。本研究自河北省5个代表性西瓜产区采集病样,分离纯化获得5个CGMMV河北分离物,经RTPCR扩增、基因克隆获各分离物的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因序列。使用Vector NTI 10.0软件（Informax,Frederick,MD,USA）和MEGA5.0软件（Koichiro,Tokyo,Japan）对河北省5个分离物及GenBank已登录其它分离物CP进行序列分析,构建系统发育树。系统进化关系分析表明：所有CGMMV分离物可划分为5个组,CGMMV河北分离物与中、日、韩三国分离物亲缘关系较近,位于同一组别。与希腊2个分离物（CGMMV-GR5、GR3）亲缘关系最远。CGMMV CP序列相似性分析结果表明：河北省5个分离物CP核苷酸、氨基酸序列相似性在99%~100%之间,与其它17个分离物序列相似性在92%~100%之间。与中国LN及Liaoning两个分离物及韩国Watermelon分离物相似性最高为100%,与希腊2个分离物（GR5、GR3）序列相似性最低为92%~99%。揭示了CGMMV河北分离物的分类地位及其与不同来源分离物之间的遗传进化关系,为进一步研究CGMMV株系划分、基因遗传变异提供了理论基础。

黄瓜绿斑驳病毒人工诱变方法的研究

以黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus)野生株系为试材,采用高温处理、亚硝酸处理及复合处理对其进行人工诱变,比较3种诱变方法致弱效果。结果表明:3种方法均具有削弱病毒群体在苋色藜上枯斑扩展的能力,野生株系接种苋色藜后,直径小于1mm枯斑比率为1.99%,亚硝酸处理、高温处理、复合处理小枯斑比率分别为11.41%、12.87%、14.20%,复合处理致弱效果最好。该结果有助于快速有效的筛选CGMMV弱毒株,也将为弱毒疫苗的开发和致病相关基因功能的研究奠定基础。

西瓜感染黄瓜绿斑驳病毒的症状及防治方法

总结了黄瓜绿斑驳病毒侵染西瓜的症状,并提出防治方法,以期为黄瓜绿斑病毒的防治提供参考。

黄瓜资源对黄瓜绿斑驳病毒广东分离物的抗性水平鉴定

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是严重威胁葫芦科作物生产的毁灭性病原之一,该病毒已入侵我国十多个省份,危害西瓜、黄瓜等作物并造成严重的经济损失。早在2009年广东即发现CGMMV为害西瓜和黄瓜,但黄瓜等葫芦科作物对其抗性情况尚不清楚。【方法】采用人工机械摩擦接种方法,测定了14份黄瓜种质资源对CGMMV广东分离物的抗性水平。【结果】从广东葫芦病样中分离获得CGMMV,该病毒分离物MP基因序列与国内报道的各分离物同源率均在99%以上;14份黄瓜种质资源对该病毒分离物均表现为感病。【结论与意义】广东主要黄瓜资源对CGMMV均表现为感病,这为我省防控该病毒病提供了科学依据,也为黄瓜抗病育种提供了指导。

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。

黄瓜绿斑驳花叶病毒安徽分离物全基因组序列测定及分析

通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR等手段对采自安徽和县的西瓜病株进行检测,确定其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。为明确CGMMV安徽分离物CGMMV-Anhui的分类地位,进一步克隆了该病毒的全基因组序列,分析了其基因组结构特征。结果表明,CGMMV-Anhui基因组全长为6 423bp(GenBank登录号KT236095),与已报道的CGMMV的编码区的基因结构一致,仅5′和3′端非编码区核苷酸数目略有差异。将CGMMV-Anhui与已报道的分离物的全基因组序列和外壳蛋白基因序列进行系统发育分析,显示CGMMV不同分离物可分为亚洲和欧洲两个组,安徽分离物CGMMV-Anhui与亚洲分离物亲缘关系较近,可能具有共同的侵染源。

来自安徽不同地区黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)cp基因的分子进化分析

为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。

黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率

【目的】加强种子带毒检测,防止黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)通过种子传播而导致该病害的扩散和流行。【方法】以感染CGMMV的西瓜、甜瓜病株收获的种子为材料,应用DAS-ELISA检测感染CGMMV的种子带毒率和传毒率。【结果】250粒西瓜种子全部为阳性,带毒率达100%;623株西瓜幼苗14株为阳性,传毒率为2.25%。130粒甜瓜种子122粒为阳性,带毒率达93.85%;2 050株甜瓜幼苗58株为阳性,传毒率为2.83%。灵敏度检测种子带毒量在感染种子研磨样体积与健康种子研磨样体积为1/1 000时仍检测是阳性;叶片带毒量在病叶研磨样体积与健康叶研磨样体积为1/10 000时仍检测是阳性。【结论】感染CGMMV西瓜、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主。灵敏度检测表明DAS-ELISA能进行大批量的种子检测。

检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防疫控制

综述了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus)的分布、识别特征、生物学特性、传播方式,及其检测技术和风险分析,并提出了相关防疫措施。

黄瓜绿斑驳花叶病毒生物学特性及对西瓜生长的影响

对黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)在辽宁省的分布、生物学特性及病毒侵染对西瓜产量和品质的影响进行了研究。结果表明:CGMMV在辽宁省的营口、鞍山、沈阳、丹东、大连、辽阳等地均有分布;在供试的5科21种植物中,病毒仅可侵染葫芦科的西瓜、黄瓜、葫芦、南瓜、角瓜、甜瓜、瓠瓜7种植物,并表现系统花叶症状。该病毒致死温度95～100℃,稀释限点10-4～10-5,体外保毒期119d。电镜观察病毒粒子直棒状,长300nm,宽15nm。RT-PCR检测表明,盖州、台安、新民的西瓜花叶样品为黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜株系。利用春秋两季大棚栽培西瓜接种试验表明,西瓜感染CGMMV后,导致植株生长缓慢,结瓜稍小,自根西瓜产量减产幅度很大,秋季大棚减产38.7%～47.6%,春季大棚减产11.4%～19.4%;采用葫芦嫁接的西瓜产量损失变化较小,秋季大棚减产3.4%～17.5%,春季大棚减产2.5%～9.1%。另外,研究结果表明,CGMMV侵染直接导致西瓜倒瓤,使西瓜丧失食用价值,血清学检测倒瓤西瓜携带CGMMV。

侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定

从广西南宁市郊温室大棚中的葫芦[Lagenaria siceraria(Molina)Stand.]上采集到一个表现脉绿、花叶症状的病毒样品,ELISA检测表明,该样品与黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)有密切的血清学关系,利用RT-PCR方法从样品中扩增获得约500bp的DNA片段,序列分析表明,该片段是CGMMV的外壳蛋白基因,暂将该病毒分离物定名为GX-BG。外壳蛋白基因核苷酸序列系统进化树分析表明,已报道的CGMMV主要分为3大群体,GX-BG与中国辽宁分离物(CGMMV-LN)分别属于不同的群体。

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定

为确定从江苏省洪泽县大棚西瓜、仪征市露地瓠瓜、东台市露地南瓜上采集到3个表现为褪绿、斑驳花叶症状的病样是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)侵染,采用电子镜观察、RT-PCR和序列测定方法对其进行鉴定。电子显微镜下可见300 nm×18 nm大小的直杆状病毒粒子。根据已报道的CGMMV外壳蛋白质(cp)基因序列合成特异性引物,对所提取病样的总RNA进行RT-PCR扩增,3个分离物的RNA模板中均可扩增到大小为500 bp左右的DNA片段,测序结果表明3个分离物的片段均含有486个核苷酸,包含完整的cp基因,编码161个氨基酸。3个分离物与已报道的7个CGMMV分离物核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为91.8%～99.8%和98.1%～100.0%,与同属的其他3个病毒(Kyuri绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实斑驳花叶病毒和小西葫芦绿斑驳花叶病毒)cp基因核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为40.7%～54.7%和44.4%～60.2%,表明所采集的3个病样由CGMMV侵染引起。

江苏黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生和防治

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是2012年江苏新发生在葫芦科作物上的一种病毒病害,主要发生在大棚西瓜上,病源随西瓜种子或种苗调运进入江苏,目前在苏南、苏中、苏北等地均有发现。本文叙述了CGMMV的特点、分布、传播途径和危害规律,确定绿脉、斑驳为其特征性症状的简易识别方法和5月份前在大棚西瓜发生的花叶病毒病多数为CGMMV危害的辅助识别手段,提出目前江苏该病毒防治应在加强宣传培训的基础上采用"检、消、扑、治"的防治策略。

黄瓜绿斑驳花叶病毒海南分离物基因组测定与毒源分析

为分析2012年采自海南西瓜上具黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染典型症状的病毒分离物CGMMV-HaiN12的分子特征和可能来源，以病叶总RNA为模板，分3段进行RT-PCR扩增，测定了该分离物基因组全长序列。结果表明CGMMV-HaiN12基因组全长为6425 bp（GenBank登录号KC852074），与已报道的CGMMV分离物相比，除5′和3′端非编码区核苷酸数目略有不同外，编码区的基因结构完全相同。CGMMV-HaiN12全基因组序列与韩国分离物AF417242的相似性为99．6％、遗传距离为0．004，在进化树的末端两者聚为一支。将CGMMV-HaiN12与已发布的中日韩分离物的外壳蛋白基因序列进行遗传进化分析，所有分离物在0．000～0．027的遗传距离上聚为一支，显示这些分离物具有高度的相关性，而与欧洲的西班牙和俄罗斯的2个代表分离物具有较大差别。在进化树末端，CGMMV-HaiN12与3个韩国分离物（AJ245440、JF838188、AF417242）、2个我国湖南分离物（JQ715592、JQ715595）聚为一支，表明CGMMV-HaiN12可能由韩国传入，并且与传入我国湖南的分离物高度同源。在海南本地不进行西瓜制种的情况下，为控制CGMMV在海南的危害应加强对进入海南的西瓜和砧木种子的检疫工作。

黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物的分子鉴定

采用RT-PCR方法,扩增并测定了黄瓜绿斑驳花叶病毒广东分离物(CGMMV-GD-GZ,CGMMV-GD-LZ,CGMMV-GD-LF)的外壳蛋白(coat protein,CP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因序列。结果显示,CP基因序列全长486 bp,编码161个氨基酸;MP基因全长795 bp,编码264个氨基酸。CGMMV广东分离物与其他15个CGMMV分离物之间外壳蛋白基因核苷酸的同源性在90.9%～100%之间,运动蛋白核苷酸同源性为92.7%～100%;与同属其他13种病毒基因组核苷酸序列同源性分别仅为29.5%～56.2%和38.8%～61.8%。基于外壳蛋白和运动蛋白基因序列构建系统发育树显示,CGMMV不同分离物进化为亚洲和欧洲两大群体,3种CGMMV广东分离物与韩国、日本等亚洲分离物同源性极高,可能具有共同的侵染源。

免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑.

黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测

【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。

黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)辽宁分离物繁殖在葫芦(Lagenaria siceraria)上,用葫芦作为繁殖寄主进行病毒提纯,将提纯病毒制剂免疫家兔制备多克隆抗体,抗体效价为1∶320000,建立了间接ELISA检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测病汁液的灵敏度为1∶32000,检测提纯病毒的灵敏度为4.75×10-5mg。

干热处理对葫芦科种子质量的影响及对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治效果

以葫芦和南瓜种子为材料,比较了68、72、75、80℃4个干热处理温度条件及6℃和常温2种种子保存条件对种子质量的影响;通过田间栽培试验检测了种子干热处理对黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的防治效果。结果表明:68~80℃的温度处理种子72 h后,不会影响葫芦种子的发芽势和发芽率,但显著降低了南瓜种子的发芽势和发芽率。高温干热处理后,3个葫芦品种的种子分别在常温和6℃下保存15个月后,种子发芽势均显著下降;2个南瓜品种分别在常温和6℃下保存12个月后,除68℃和72℃处理的南瓜京欣砧2常温保存种子的发芽势以外,其他处理种子的发芽势和发芽率都显著下降。通过3 a 3种不同栽培模式的田间试验,不同带毒率的葫芦砧木种子经过72℃干热处理72 h后,嫁接西瓜在田间均未发生CGMMV。试验结果表明,不同葫芦科作物种类,甚至不同品种对温度的敏感性不一样;干热处理种子是防治CGMMV最有效的方法之一。

黄瓜绿斑驳花叶病毒北京和山东分离物的生物学测定及其基因组比较

为揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子流行学特征,通过RT-PCR和cDNA克隆技术获得并分析了从北京甜瓜和山东西瓜上分离的2个黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)分离物CGMMV-Beijing和CGM-MV-Shandong的全序列。结果表明CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong的基因组分别由6423和6427个核苷酸组成,包括5′及3′端非编码区和4个开放性的阅读框,分别编码129kDa和186kDa复制相关蛋白、29kDa的移动蛋白及17.4kDa的外壳蛋白。寄主范围测定显示在供试的6科11种植物中CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong均可侵染葫芦科的葫芦、南瓜和西瓜以及茄科的本氏烟和藜科的苋色藜,不侵染供试的其它植物。CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong基因组的核苷酸同源性为99.5%,186kDa蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.7%和99.8%,移动蛋白的核酸和氨基酸同源性分别为99.3%和98.1%,外壳蛋白的核苷酸同源性为100%。多序列比对分析结果显示,CGMMV的各分离物之间的分子差异并不明显,核苷酸同源性均在98%以上。将CGMMV-Beijing和CGMMV-Shandong与侵染葫芦科植物的烟草花叶病毒属其它成员比较,结果显示其亲缘关系较远,基因组的核苷酸同源性介于56.7%～59.6%,外壳蛋白的氨基酸同源性在44.7%～54.0%之间。综合分析显示,CGMMV分离物之间的差异并不明显,可能具有共同的侵染来源。