不同性别类型黄瓜ACC合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记

黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据ACC合酶基因家族的保守序列设计PCR引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)片段(GenBank登记号为:DQ115884～DQ115886和DQ115875～DQ115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(SNPs)标记,SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换.在8个SNPs中,有1个SNP位于内含子区域,其余7个SNPs都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的SNPs中,有3个为非编码区的SNPs,4个为cSNPs.而在4个cSNPs中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示ACC合酶基因CS-ACS2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据SNP多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记C-MT700.利用CAPS标记C-MT700能将强雌性优良品种MT-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的SNPs标记和CAPS标记丰富了黄瓜的分子标记种类.

不同性别表型黄瓜基因组中雌性系特异的ACC合酶基因

利用一对引物 (引物 1和引物 2 )分别从雌性系黄瓜 (CucumissativusL .)品种“CORONA”、“DALEVE”和强雌性黄瓜品种“中农五号”、“欧洲八号”的基因组DNA中扩增到一长约 10 2 5bp的ACC合酶基因片段。序列分析表明 :该基因片段与Trebitsh等 1997年发表的ACC合酶基因片段的同源性大于 99% ,认为这两个基因片段应该是同一个基因 ,不同品种来源的该基因的相同性说明了其高度的保守性 ,并暗示了该基因在黄瓜性别决定中的重要作用。此基因片段与其他在不同诱导条件下表达的ACC合酶基因的同源性较低 (小于 70 % )。Southern分析表明此基因片段与黄瓜的性别表型有关 ,是雌性系黄瓜特有的。此基因的存在与黄瓜的雌性表达为“有”和“无”的关系 ,其拷贝数的多少与雌性表达强弱并无直接相关性 ,暗示在黄瓜中另有与雌性表达强弱有关的基因。

黄瓜性别决定基因相关的分子标记

以不同性别类型的黄瓜高代自交系为材料,根据GenBank中提供的乙烯合成、信号转导有关基因序列、花器官发育相关的黄瓜性别决定蛋白基因、AGMOUS同源异型基因、与性别表达相关的RAPD和ISSR引物,采用Primer Premier 5.00专业引物设计软件,设计可能与性别表达有关特异引物.结果表明,ACS1号引物对(ACS-F1,5′-ATTCAGATGGGT-3′;ACCS-R1,5′-GCCAAAGCTCGACAT-3′),CsACS1G-SCAR引物对(ACS-F1,5′-TTAACTACTTCGGACGGGCATAG-3′;ACCS-R1,5′-AGGTGTTCAGCAAA CATAGGGTG-3′)及RAPD引物S12对不同性别类型的黄瓜基因组DNA的PCR扩增产物表现出明显的多态性.用Mapmaker/Exp 3.0进行连锁分析,发现雌性F基因和ACS_280,CsACS1G-SCAR_430均连锁群,遗传距离分别为31.4,10.0 cM,与S12_280标记不在一个连锁群上.

黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选

利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用 30 0个 1 0碱基的随机引物按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增 ,筛选出 5个在全雌和弱雌株基因池 (genepool)中表现多态性的引物。单株检测表明 ,引物B1 1具有全雌特异性 ,在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约 1 0 0 0bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此 ,将该全雌性特异的片段命名为B1 1 1 0 0 0 。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外 ,以ACC合酶基因 (CS ACS1 )特异引物检测分离群体单株 ,发现该酶基因存在于所有性型的单株中 。

黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布

根据已有的决定黄瓜雌性的ACC合酶基因CS-ACS1G,与黄瓜性型有关的ACC氧化酶基因CS-ACO2、CS-ACO3,与黄瓜雌性相关的乙烯受体基因CS-ETR2和CS-ERS的序列,通过设计特异引物,对不同性型黄瓜品种基因组DNA进行扩增。结果表明,5个基因在本试验所用的不同性型黄瓜品种的基因组中均能被检测到,说明这5个性别决定相关基因在本试验中不具有雌性特异性。通过PCR克隆在全雌性黄瓜品种G5224中获得了长度为1124bp的ACC合酶基因序列。BLAST分析表明,本试验所获得的ACC合酶基因序列和Trebitsh公布的CS-ACS1G基因序列的同源程度为99%,表明PCR扩增产物确实为CS-ACS1G基因。此基因在基因组中表现不具雌性特异性的现象与多数研究者的结论相悖。