钝齿棒杆菌黄素血红蛋白Hmp在L-精氨酸合成中的作用

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室选育的一株L-精氨酸高产菌,基于前期转录组和蛋白组数据分析,发现黄素血红蛋白(flavohemoglobin,Hmp)在高氮源相对于低氮源条件下表达水平上调,进一步研究Hmp的抗氧化胁迫功能和在L-精氨酸合成中的作用.构建了hmp过表达和敲除菌株,首先以Hmp蛋白为研究对象,分析Hmp的圆二色谱结构,用SWISS-MODEL建模分析,测其NAD(P)H氧化酶酶活,验证了Hmp的结构与功能.接下来研究Hmp与氧化应激之间的关系,首先测定发酵过程胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)酶活,最后通过5-L发酵罐扩大发酵体系来探究Hmp在L-精氨酸合成中的作用.过表达hmp在发酵过程中降低了活性氧水平,分别提高了9.2%和8.7%的SOD和CAT酶活,促进了菌体生长代谢和提高目标代谢产物的积累.通过检测发酵过程的细胞干重、葡萄糖含量和L-精氨酸产量,发现hmp过表达菌株Cc-hmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别提高了19.7%和29.6%,hmp敲除菌株Cc-Δhmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别减少37.9%和14.8%.本研究表明高氮高溶氧条件下,使用发酵法生产L-精氨酸的过程中,氧化应激的产生及带来的氧化损伤不可避免,Hmp可以有效抵抗胞内氧化应激,改善胞内的氧化还原状态,维持一个良好的胞内环境,从而提高L-精氨酸的产量.(图10表3参31)

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

【目的】构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin,HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide,NO)能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠(SNP)为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。