黄肿树JcFATA基因原核表达载体构建及表达体系优化

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A(fatty acyl acyl carrier protien thioesterase,FATA)是脂肪酸积累过程中的关键酶,直接调控脂肪酸的含量与组成。目前有关黄肿树脂酰-ACP硫酯酶A基因(Jc FATA)(Gen Bank登陆号:EU267122.2)的功能研究还未见报道。对Jc FATA基因进行原核表达是研究Jc FATA基因功能的一种重要手段,而开展这项研究的前提是构建原核表达载体。因此,本研究以黄肿树c DNA为模板克隆出Jc FATA基因原核表达片段,将其连接到带有His标签的原核表达载体p Cold I上,将所构建的重组载体p Cold I-Jc FATA转入大肠杆菌Rosseta。为了表达更多的可溶性His-Jc FATA融合蛋白,本文还探讨了不同IPTG浓度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)、不同诱导温度(15、25、37℃)和不同诱导时间(0、15、30 h)对蛋白表达的影响,诱导产物经超声波裂解破碎后,利用SDS-PAGE比较分析融合蛋白表达量,从而确定最佳的表达体系。结果表明,当添加诱导剂IPTG的浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为15 h,培养温度为25℃时,可以获得较多的可溶性融合蛋白(His-Jc FATA)。此外,进行蛋白纯化时发现,在镍柱上进行第5次洗脱时所获得纯化蛋白质量最佳。本研究的结果可为进一步研究Jc FATA基因的功能奠定基础。