功能型DNA重组修复蛋白质RecR的体内分布示踪

RecR是参与大肠杆菌(E.coli)同源重组的蛋白质,在真核生物中存在功能保守性组分.通过构建recR-yfp融合基因及其表达载体,对大肠杆菌菌体内RecR蛋白的分布情况进行了活体观察.显微镜观察结果表明,RecR蛋白一般在菌体的拟核区起作用.通过对比紫外线敏感性,Re cR-YFP在重组质粒上提高了recR缺陷型大肠杆菌的抗紫外线能力,表明重组质粒表达的融合蛋白RecR-YFP具有生物活性,能够提高recR缺陷型大肠杆菌的存活率.

γ-干扰素基因pIRES改进型黄色荧光蛋白载体的构建

【目的】构建携带γ 干扰素基因 (ifn γ)的pIRES改进型黄色荧光蛋白载体 (pIRES EYFPIFN γ) ,为γ 干扰素基因的体内外表达及蛋白定位提供理想的标记。【方法】根据已知γ 干扰素基因序列 ,设计在目的片段两端分别带EcoRⅤ和NotⅠ酶切位点序列的 2条引物 ,用PCR技术从质粒 pcDNA3IFN γ中扩增出ifn γ(499bp) ,PCR产物用 EcoRⅤ和 NotⅠ双酶切后回收纯化 ,定向克隆至商品质粒 pIRES EYFP ,重组质粒 pIRES EYFPIFN γ用限制性内切酶酶切和DNA序列分析鉴定。同时以脂质体为介导 ,将 pIRES EYFPIFN γ转染正常人眼Tenon囊成纤维细胞 ,4 8h后于荧光倒置显微镜下观察基因的表达。【结果】DNA序列分析证明PCR产物为ifn γ ,将重组质粒转染正常人眼Tenon囊成纤维细胞 ,荧光倒置显微镜下可见黄色荧光蛋白的表达 ,转染率约为 4 3%。【结论】成功构建 pIRES EYFPIFN γ载体为利用黄色荧光蛋白标记在体内外进行γ

DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立

目的 建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株 ,用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系。方法 运用基因工程的方法获得hMSH2cDNA片段 ,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上 ,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞 (HLF) ,使之在HLF中表达 ,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平。结果 构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体 ,并在真核细胞成功表达 ;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了 4 4 %。结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段。

美科学家拍摄到人体DNA修复重要环节

据东方网2009年2月3日援引《科技日报》消息，美国加州大学戴维斯分校研究人员借助荧光蛋白标记技术，观察和拍摄到了人体受损DNA修复过程中的一个重要阶段，证明了Rad51蛋白在受损DNA修复活动中起关键作用。

紫杉醇联合骨髓基质干细胞种植体外修复内皮及对血管平滑肌增生的影响

目的探讨紫杉醇联合骨髓基质干细胞种植体外修复内皮的可行性及对血管平滑肌细胞增生的影响。方法培养兔主动脉内皮、平滑肌和人骨髓基质干细胞,通过细胞共培养将内皮/骨髓基质干细胞接种于下室、平滑肌细胞接种于上室模拟血管内皮修复过程,分别用3H TdR掺入和Westernblot检测紫杉醇(1,10,100nmol/L)干预20min后第10天平滑肌DNA合成和PCNA蛋白表达,用免疫荧光细胞化学法观察与紫杉醇干预内皮共培养的骨髓基质干细胞vWF和Flk1蛋白表达。结果骨髓基质干细胞种植组平滑肌细胞3H TdR掺入和PCNA蛋白光密度相对值均高于融合内皮组(n=6,P<0.05),低于对数内皮组(n=6,P<0.05)。共培养前骨髓基质干细胞不表达vWF和Flk1蛋白,与紫杉醇干预内皮共培养10天时vWF染色阴性,但部分骨髓基质干细胞开始表达Flk1蛋白。结论骨髓基质干细胞种植能部分抑制紫杉醇引起的平滑肌细胞延迟增生,与紫杉醇干预内皮共培养的骨髓基质干细胞有向内皮分化的能力。

DNA疫苗体外与体内表达及鉴定方法的建立

为了确定作为疫苗的质粒DNA能否在真核细胞中表达和探讨其是否有可能和宿主DNA发生整合,基于弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6建立了鉴定DNA疫苗在真核细胞内表达以及其是否与宿主DNA重组的方法。以黄色荧光蛋白为标记优化DNA疫苗体外转染真核细胞的最佳条件,然后通过RT-PCR和Western-blot方法对目的蛋白GRA6的表达进行了鉴定。DNA疫苗免疫小鼠后,在不同时间点用PCR方法检测质粒DNA在体内组织样本中的分布,探讨了质粒DNA是否能与宿主DNA发生整合。结果显示,弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6在质粒DNA与转染试剂的比例为1∶8时体外转染效果最好,RT-PCR和Western-blot方法均证明其可以在真核细胞中表达。免疫后第28天,pcDNA3.1-GRA6免疫组小鼠的脾、肝等组织的基因组DNA样品均可扩增出GRA6基因片段;而免疫后第56天,各组织均未扩增出特异性GRA6基因片段。表明质粒DNA只能短暂存在于体内。因此,DNA疫苗重组质粒体外与体内鉴定方法的建立,为DNA疫苗开发提供了一个较为系统的研究基础。

活性氧在4-HPR诱导膀胱癌细胞T24凋亡中的作用

目的研究4HPR诱导的膀胱癌细胞凋亡,探讨DNA氧化损伤与修复在其中的作用。方法以4HPR处理T24细胞后,检测其生长抑制情况,用荧光分光光度计检测细胞内活性氧(ROS)含量,用流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况,用Westernblot法检测DNA修复蛋白XRCC1的表达。结果4HPR能诱导细胞发生凋亡,2.5、5.0、10.0μmolL4HPR引起的凋亡率分别达到1.8%、4.0%和10.5%,在此过程中伴随着细胞内ROS水平升高(最高达到3倍),并使DNA修复蛋白XRCC1的表达下降,使caspase3激活。抗氧化物质维生素C能有效地抑制4HPR引起的ROS升高,并能部分抑制其引起的细胞生长抑制、凋亡及XRCC1蛋白表达的下降。结论ROS的生成并造成DNA损伤可能是4HPR诱导膀胱癌细胞凋亡的主要机制。