基于网络药理学、分子对接技术及实验验证研究黄芪提取物治疗缺血缺氧性脑病的机制

运用网络药理学、分子对接技术探究黄芪提取物治疗缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的机制,并进行实验验证。通过中药系统药理学数据库平台(TCMSP)、UniProt、GeneCards和OMIN数据库获得黄芪提取物的主要活性成分和基因靶点,通过GeneCards数据库获得HIE的相关靶点;利用Cytoscape软件构建黄芪提取物“活性成分-药物靶点”网络。应用PDB和TCMSP数据库获取分子结构,使用SYBYL-X2.1软件进行模拟分子对接。建立大鼠动物试验模型,采用Western blot法检测关键蛋白的表达情况。根据TCMSP数据库,共得到黄芪提取物的70个活性成分及其350个相关靶点,去除重复靶点和基因注释后,最终获得“黄芪提取物”有效成分的120个靶点。通过将黄芪提取物的120个靶点与HIE的前242个靶点(相关性分数>5)相映射,筛选出黄芪提取物治疗HIE的18个潜在靶点,发现4-羟基肉桂酸、顺式阿维酸、黄芪紫檀烷苷、常春藤皂苷元、华良姜素为关键活性成分。将18个潜在靶点输入STRING中进行蛋白相互作用分析,共发现3个核心靶点(degree值>30),分别为诱导型一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)、前列腺素氧化环化酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)。动物实验显示,黄芪提取物能够降低大鼠模型海马组织内的NOS2、PTGS2、MAPK4、CASP8蛋白表达。通过网络药理学分析和实验验证得出黄芪提取物能够通过多靶点、多通路起到抑制神经元凋亡、保护神经细胞的作用。

黄芪提取物对帕金森病小鼠黑质区白介素-17通路的影响

目的:探究黄芪提取物干预白介素-17(IL-17)信号通路治疗帕金森病(PD)作用机制。方法:将30只雄性C57BL/6小鼠均分为五组。除对照组之外均采用MPTP诱导PD模型,建模成功后,低、中、高浓度黄芪组分别以50、100、200 mg/kg黄芪提取物持续灌胃14 d,模型组和对照组采用等量0.9%氯化钠溶液灌胃。灌胃后结束后采用转棍实验和爬杆实验评估各组小鼠行为表现。免疫组化法测定各组脑黑质致密区(SNpc)酪氨酸羟化酶(TH)和Th17细胞数目;Western blot测定纹状体区IL-17、抗肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、核因子-κB(NF-κB)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白相对表达量。结果:与对照组比较,模型组和各浓度黄芪组小鼠转棍掉落潜伏期明显缩短,爬杆实验头向下时间(T1)、由杆顶爬至杆底所用时间(T-LA)明显延长,SNpc区TH表达水平下降,Th17细胞数目增多,纹状体区IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相对表达水平明显升高(均P<0.05)。与模型组比较,各浓度黄芪组小鼠转棍掉落潜伏期明显延长,爬杆实验T1和T-LA明显缩短,SNpc区TH表达水平升高,Th17细胞数目减少,纹状体区IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相对表达水平明显下降(均P<0.05),且与黄芪提取物浓度呈正相关。结论:黄芪提取物能有效改善PD模型小鼠转棍和爬杆活动能力,保护SNpc区TH阳性神经元,其机制可能与抑制IL-17/TRAF-6/NF-κB信号通路,减少多巴胺神经元炎症性损伤凋亡有关。

黄芪提取物对鲫鱼抗氧化功能的影响

为研究黄芪提取物对鲫鱼机体抗氧化功能的影响,探讨了黄芪提取物在鲫鱼养殖中最适添加水平。按照单因素试验设计原则,以饲料中添加黄芪提取物为变量,将试验鲫鱼分成5个处理组,养殖试验鲫鱼8周。试验结束后,采集各组鲫鱼的血液,收集血清检测血清抗氧化指标。结果显示,试验组2和试验组3鲫鱼血清丙二醛水平显著降低(P<0.05),谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活力显著提高(P<0.05);试验组2、试验组3和试验组4血清超氧化物歧化酶活力显著提高(P<0.05)。研究表明,在鲫鱼生产中添加适量的黄芪提取物可以显著增强机体的抗氧化功能,综合各项指标数据,黄芪提取物的最适添加量为500~1000 mg/kg。

黄芪提取物免疫调节活性的体外实验研究

目的 :研究黄芪提取物 (Astragalusmembranaceusextract ,AME)对人的外周血免疫细胞(PBIC)免疫功能的调节作用。方法 :采用3H TdR掺入法分析AME对外周血单个核细胞 (PBMC)的增殖活性及对外周血粘附单核细胞 (PBAM )吞噬肿瘤细胞的影响 ;采用51Cr释放法测定AME对杀伤性T细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞的影响 ;用ELISA法和生物学法研究AME对外周血B细胞 (PBBC)产生IgG及对PBAM产生细胞因子的影响 ;采用SDS PAGE分析AME的蛋白组成。结果 :AME能促进PBMC的增殖 ;提高CTL对肿瘤细胞的杀伤活性 ;增强PBAM对肿瘤细胞的吞噬和产生细胞因子的功能 ;促进了PBBC产生IgG ;AME含有多种蛋白成分。结论 :AME对人免疫功能有增强作用 ,提高了抗肿瘤免疫效应 。

黄芪提取物对局灶性脑缺血再灌注损伤的抗氧化及线粒体保护作用

目的 研究黄芪提取物 (Extractofastragalus,EA)对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的抗氧化及线粒体保护作用。方法 采用栓线法复制局灶性脑缺血 (MCAO)再灌注损伤模型,观察EA对大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸 (LD)的影响;检测脑组织线粒体组分中的SOD、MDA含量及ATP酶活性的变化 ;电镜观察缺血再灌注后脑组织神经元超微结构的改变。结果 EA对大鼠MCAO2h再灌注 24h后脑组织及其线粒体组分中SOD活性的降低有明显的抑制作用,能抑制大鼠脑组织和脑组织线粒体组分中MDA含量的增加,能抑制大鼠脑组织LD含量的增加; EA可明显提高脑组织线粒体组分中Na+,K+ ATPase,Ca2+,Mg2+ ATPase活性;电镜照片显示EA组能改善脑组织神经元在脑缺血再灌注后的结构破坏情况。结论 EA对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用的机制可能与其抗脂质过氧化和保护线粒体的作用有关。

黄芪提取物对全脑缺血损伤的保护作用

目的 研究黄芪提取物 (EA )对大鼠和小鼠全脑缺血的保护作用。方法 采用小鼠双侧颈总动脉结扎法 ,造成全脑急性缺血模型 ,观察小鼠 12h内存活时间 ,并记录 2、6、12h小鼠死亡率。参照Pulsinelli法制作大鼠全脑缺血再灌注模型 ,观察EA的神经保护作用 ,记录脑电图 (EEG) ,观察并记录大鼠全脑缺血后翻正反射 (rightingreflex ,RR )恢复时间 ,测定脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH Px)、乳酸脱氢酶 (LDH)、一氧化氮合酶 (NOS)活性 ,测定组织中诱导型NOS(iNOS)的表达并运用图像分析系统定量分析海马区平均光密度值 (meanopticaldensity ,MOD)。 结果 EA能降低急性脑缺血小鼠的死亡率 ,延长 12h内小鼠存活时间。EA能促进大鼠EEG和翻正反射的恢复 ,可显著提高全脑缺血再灌注大鼠脑组织中GSH Px、LDH活性 ,降低NOS活性 ,抑制海马iNOS的表达 ,降低其MOD值。

黄芪提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症因子及细胞凋亡的作用

目的研究黄芪提取物(EA)对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法采用线栓法大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,以免疫组化法观察EA对缺血再灌注后大鼠脑组织中TNFα表达的影响、以放免法观察对IL1β水平的影响、以TUNEL法观察对脑组织细胞凋亡的影响。结果与模型组比较,EA(20、40、80mg·kg-1,ig)能减少TNFα的表达、降低IL1β水平和减少细胞凋亡数。结论EA对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织中TNFα及IL1β的升高和神经元的凋亡有明显的抑制作用。

黄芪提取物的体外抗乙肝病毒作用

目的 研究黄芪提取物抗乙型肝炎病毒 (HBV)作用。方法 采用ELISA法观察两种黄芪提取物黄芪总苷(AST)、黄芪多糖 (ASP)对HBV DNA转染的HepG2 2 2 15细胞分泌表面抗原 (HBsAg)和e抗原 (HBeAg)影响 ,同时用3 H TdR掺入法检测HepG2 2 2 15细胞增殖。结果 AST( 4 0、80、16 0mg/L)、ASP( 2 5 6、5 12mg/L)对HBsAg、HBeAg分泌有抑制作用 ,ASP( 12 8mg/L)还可以抑制HBsAg分泌。AST( 4 0、80、16 0mg/L)、ASP( 12 8、2 5 6、5 12mg/L)可抑制HepG2 2 2 15细胞的增殖。抑制HepG2 2 2 15细胞分泌HBeAg、HBsAg和细胞增殖的半数有效浓度 (EC50 ) ,AST为88 14、92 0 7、32 81mg/L ,ASP为 35 0 5 9、35 4 38、139 5 5mg/L。结论 AST、ASP在体外实验中有抗HBV和抑制HepG2 2 2 15细胞增殖的作用 ,AST作用优于ASP。

黄芪提取物保护Aβ致海马神经元损伤

目的探讨黄芪提取物在Aβ所致海马神经元损伤中的作用。方法通过对孕18d胎鼠的海马神经细胞培养,观察Aβ对神经细胞的毒性及黄芪提取物的保护作用。采用LDH法和MTT法检测细胞活力,LSCM测胞质钙离子浓度的变化及TUNEL法测细胞凋亡。结果Aβ与细胞孵育后,细胞活力明显下降,并呈时间和剂量依赖性,同时细胞内钙显著上升,细胞出现凋亡的典型的形态学特征。20、40μg·L-1黄芪提取物能明显提高细胞活力、降低胞质钙离子浓度、减少凋亡的细胞数。结论黄芪提取物对Aβ所致海马神经元损伤具有一定的保护作用,可能与其降低海马神经元胞质钙离子有关。

HPLC-ELSD法测定黄芪提取物中黄芪甲苷的含量

目的 :研究喷雾干燥法制备黄芪提取物中黄芪甲苷的HPLC ELSD测定方法。方法 :黄芪醇提液经浓缩后喷雾干燥 ,采用蒸发光散射检测器 (ELSD)以黄芪甲苷为对照品对黄芪提取物中的黄芪甲苷进行HPLC分析 ,色谱柱 :Elite ODS ,流动相∶乙腈 水 (36∶6 4) ,流速 :1.0ml/min ,ELSD参数 :漂移管温度为 10 5°C ,N2 流速为 2 .84ml/min。结果 :按选定的色谱条件测定 ,线性良好 ,平均加样回收率达 91.6 8% ,RSD为 1.6 4% ,实验还发现喷雾干燥过程中加入可溶性淀粉有助于粉末形成 ,但对含量测定有影响。结论 :本方法对黄芪甲苷的测定良好 ,应寻找更好的喷雾干燥助剂。

黄芪提取物对肉仔鸡生长、免疫器官发育及抗氧化功能的影响

选择300只1日龄艾维茵肉仔鸡,随机分为5个处理,研究黄芪提取物对肉仔鸡生长、免疫器官发育及抗氧化机能的影响。结果表明:添加0.2%、0.3%黄芪提取物能显著(P<0.05)提高肉仔鸡日增重和饲料转化效率、血清谷胱甘肽过氧化物酶活性、胸腺指数和法氏囊指数,降低血清丙二醛含量。由此得出,日粮中添加黄芪提取物可以提高肉仔鸡生长性能,促进其免疫器官发育,改善机体抗氧化机能。

黄芪提取液对犬离体肾低温灌注与保存影响的实验研究

目的 :研究黄芪提取液对犬离体肾低温灌注及保存中缺血再灌注损伤的影响。方法 :以常规高渗枸橼酸盐腺嘌呤液 (HC A液 )为对照组 ,以HC A液添加黄芪提取液为实验组 ,分别对离体犬肾进行低温灌注保存 ,通过光镜、电镜观察肾组织结构变化 ,并建立犬肾移植模型 ,检测移植前后生化指标变化 ,并进行综合分析。结果 :实验组保存的犬肾组织超微结构损伤明显轻于对照组。移植肾早期功能指标检测 ,实验组血肌酐值明显低于对照组 ,而内生肌酐清除值明显高于对照组 ,两组比较 ,差异均具有显著性 (P <0 0 5 )。结论 :黄芪提取液用于肾脏低温灌注保存中 ,对缺血再灌注损伤的肾脏有一定保护作用。

黄芪提取物与红花总黄酮配伍对急性血瘀大鼠血液流变学的改善作用

目的观察黄芪提取物(EAM)与红花总黄酮(ECT)配伍对急性血瘀模型大鼠血液流变学指标的影响。方法大鼠随机分为正常对照、急性血瘀模型、阳性对照阿司匹林100 mg·kg-1,EAM400 mg·kg-1,ECT 200 mg·kg-1,EAM 400 mg·kg-1+ECT 200 mg·kg-1组。每天早晚各给药1次,共7次。第5次给药后,大鼠sc给予肾上腺素加冰浴制备急性血瘀模型。锥板法测定全血黏度和血浆黏度;微量毛细管法测定血细胞比容(Hct);光电比浊法测定二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集;光电电磁法测定凝血参数。结果与正常对照组相比,模型组大鼠全血黏度和血浆黏度升高,红细胞聚集指数和血小板最大聚集率显著增加,Hct显著升高,纤维蛋白原(Fib)含量显著增加,凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)均显著缩短(P<0.01)。与模型组相比,单独应用EAM和ECT均能显著降低全血黏度及血浆黏度,明显降低Hct、红细胞聚集指数和血小板最大聚集率,其中EAM还能显著降低Fib含量,延长APTT和TT;ECT还能显著延长PT。与单独应用EAM或ECT相比,EAM与ECT配伍能进一步改善血液流变学指标,在延长TT上优于单用ECT(P<0.05),对血小板最大聚集率的抑制作用优于单用EAM或ECT(P<0.05)。与阿司匹林相比,单用EAM或ECT抑制血小板聚集的作用不及阿司匹林,但EAM降低Fib的作用较好,ECT延长PT的作用较好;EAM与ECT配伍对血液流变学的改善作用与阿司匹林相似。结论 EAM和ECT单用能显著改善血瘀模型大鼠血液流变学指数,且二者配伍后能增强对血瘀模型大鼠血液流变学的改善作用。

黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用

目的:研究黄芪提取物(RAE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促血管新生作用。方法:以体外培养HUVEC为模型,XTT法及细胞计数法检测不同剂量黄芪提取物对细胞增殖的影响;细胞迁移实验检测加药后细胞迁移能力;采用Transwell chamber进行细胞侵入实验检测黄芪提取物对细胞侵入能力的影响;管形形成实验观察加入黄芪提取物后细胞分化情况。结果:XTT法检测HUVEC在黄芪提取物浓度为12.5μg/ml时产生最大增殖效应,增殖率为42.04%。细胞计数法测得在黄芪提取物浓度为25μg/ml时细胞数目比对照组增多124.64%。同时发现在黄芪提取物浓度为25μg/ml时能够最大能力地诱导细胞侵入和管形形成,其侵入率为66.68%,管形分枝点增值率为44.38%;而在浓度为12.5μg/ml时能够最大限度地诱导细胞迁移,迁移率为74.94%。结论:黄芪具有促进血管新生的作用。

发酵型黄芪提取物对肉仔鸡生产性能及血液生化指标的影响

将192只体重均一的21日龄肉仔鸡随机分成4组,分别饲喂正常日粮、含黄芪生药(RA)日粮、含发酵型黄芪提取物(FRAE)日粮和含黄芪多糖(AP)日粮,试验期28 d。测定肉仔鸡全程饲料利用率、日增重;50日龄心脏采血制备血清,测定其中乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酸转肽酶的酶活性,尿酸的含量。扑杀后测定器官指数,并做组织切片镜检。结果表明:①经过28 d试验,RA组的平均日增重和日采食量明显下降(P<0.05),FRAE组饲料转化率明显下降(P<0.05);②和RA组相比,FRAE组的乳酸脱氢酶活性明显降低(P<0.05),和对照组相比,RA组的γ-谷氨酸转肽酶活性明显降低(P<0.05);③显微镜下观察各组织无病理变化。结果显示,在试验期内发酵型黄芪提取物对肉仔鸡的生产性能和健康状况有明显促进作用。

黄芪提取物对鸡生长发育及免疫功能的影响

对FBC0、FJC0、精制多糖和变性蛋白质 4种黄芪提取物进行琼脂糖弥散试验 ,检测其对6株供试细菌的抗菌活性 ;将 4 0只星杂蛋雏鸡分为 5组 (1个对照组和 4个试验组 ) ,全部进行新城疫疫苗常规点眼、滴鼻免疫 ,从 7日龄起对试验组鸡饮服 4种黄芪提取物溶液 6周 ,每周进行心脏采血 ,用血凝抑制法 (HI)测定血清NDV抗体水平 ;每周称量体重 ,计算增重率 ;扑杀试验鸡 ,取胸腺、脾、腔上囊等免疫器官称量 ,计算免疫器官指数。试验结果显示 ,4种黄芪提取物的抗菌活性均为阴性 ,NDV血清抗体水平、增重及免疫器官指数等各项指标试验组均明显高于对照组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。

黄芪提取物对细菌抑制作用的研究

本文以黄芪作为研究对象,利用制得的黄芪提取物对多种细菌进行了抑菌活性实验,结果表明:黄芪提取物抑菌作用因菌种不同而最低抑菌浓度有所不同,大肠杆菌为7.5%、产气杆菌为8%、变形杆菌为4.5%、金黄色葡萄球菌为9.5%、沙门氏菌10%,其抑菌直径分别为:大肠杆菌8.6mm、产气杆菌8.1mm、变形杆菌8.2mm、金黄色葡萄球菌7.7mm、沙门氏菌8.4mm,表明对常见细菌有较好的抑制作用,其抑菌效果与时间有一定关系,在121℃湿热条件下20min后黄芪提取物抑菌效果基本不变,说明制得的黄芪提取物具有良好的热稳定性。此外,黄芪提取物抑菌浓度与时间有关。

黄芪提取物对缺氧/复氧诱导神经元损伤的保护作用

目的探讨黄芪提取物在缺氧/复氧所致神经元损伤中的保护作用。方法原代培养大鼠海马神经元细胞,建立缺氧/复氧损伤的海马神经元凋亡模型。采用四唑盐(MTT)法和LDH释放法检测细胞活力;Hoechst染色、Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测AKT和磷酸化AKT蛋白的表达。结果经缺氧/复氧后细胞活力明显下降,出现凋亡典型的形态学特征,磷酸化AKT蛋白表达下降;黄芪提取物能明显提高损伤海马神经元细胞活力,降低细胞凋亡率,促进磷酸化AKT蛋白的表达。结论黄芪提取物对缺氧/复氧神经元具有保护作用,其机制可能与激活PI3K/AKT细胞信号通路有关。

黄芪提取物对大鼠海马神经元迟发性死亡的影响

目的探讨黄芪提取物(Extractofastragalus,EA)对全脑缺血再灌注7d引起的大鼠海马神经元迟发性死亡的作用。方法用四动脉阻断法造模,观察背侧海马神经元的超微结构;CA1区神经元结构、正常神经元计数;免疫组化法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果与缺血再灌(I/R)组比较,EA能改善背侧海马神经元超微结构;抑制CA1区正常神经元数目的减少,I/R组为38±11.5,EA(20、40mg·kg-1)分别为63±12.8(P<0.05)和77±16(P<0.01);降低GFAP的表达,I/R组GFAP阳性细胞数为69±10.7,EA三个剂量组分别为53±5.6(P<0.05)、39±7.1(P<0.01)、46±7.6(P<0.05)。结论EA能抑制全脑缺血再灌注7d大鼠海马迟发性神经元死亡,可能与其抑制海马CA1区星形胶质细胞(AS)过度增生有关。