黄芪甲苷对脂多糖调节巨噬细胞M1/M2型极化的影响及机制研究

目的:评价黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对脂多糖(LPS)调节巨噬细胞M1/M2型极化的影响及其相关机制。方法:体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,采用随机数字表法分为3组:对照组(C组)、LPS组、AS-Ⅳ干预(AS-Ⅳ)组。C组细胞正常培养,LPS组加入终浓度为100 ng/mL的LPS处理24 h,AS-Ⅳ组加入终浓度为100 ng/mL的LPS和200μg/mL的AS-Ⅳ处理24 h。利用ELISA法检测白细胞介素(IL)-1β、IL-10和IL-18水平,qRT-PCR法检测CD86、CD11c、CD206和精氨酸酶-1(Arg-1)的mRNA表达,流式细胞术检测CD86(+)和CD206(+)细胞百分比,Western blot法检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白表达。结果:与C组比较,LPS组IL-1β和IL-18水平、CD86和CD11c mRNA表达、CD86(+)细胞百分比、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达升高,IL-10水平、CD206和Arg-1 mRNA表达、CD206(+)细胞百分比降低(P<0.05);与LPS组比较,AS-Ⅳ组IL-1β和IL-18水平、CD86和CD11c mRNA表达、CD86(+)细胞百分比、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达降低,IL-10水平、CD206和Arg-1 mRNA表达、CD206(+)细胞百分比升高(P<0.05)。结论:AS-Ⅳ能够抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化并促进其向M2型极化,其机制与下调NLRP3炎症小体表达有关。

黄芪甲苷对苯并芘诱导RAW264.7细胞MMPs表达的保护作用

目的观察黄芪甲苷(astragaloside IV,ASIV)对苯并芘(benzopyrene,Bap)诱导RAW264.7巨噬细胞MMPs表达的保护作用,探讨腹主动脉瘤防治的可能新策略。方法应用Western blot法观察Bap对RAW264.7巨噬细胞基质金属蛋白酶-9/12(MMP-9、MMP-12)、NF-κB、TNF-α等表达的变化及黄芪甲苷的作用,利用流式细胞仪观察黄芪甲苷对巨噬细胞ROS表达的影响。结果 Bap能够诱导RAW264.7巨噬细胞MMP-9、MMP-12等金属蛋白酶的表达升高和NF-κB、TNF-α等炎性指标的活化。黄芪甲苷具有降低RAW264.7巨噬细胞因Bap诱导而表达升高的MMP-9、MMP-12、NF-κB、TNF-α,同时具有清除ROS的作用。结论黄芪甲苷能够降低Bap刺激RAW264.7巨噬细胞引起的MMP-9、MMP-12、NF-κB、TNF-α的表达升高,并具有清除ROS的作用。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

黄芪甲苷对棕榈酸诱导的小鼠RAW264.7细胞铁死亡的调控作用

目的:探讨黄芪甲苷(astragaloside IV,ASIV)对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞铁死亡的调控作用。方法:选取对数生长期的RAW264.7细胞,加入终浓度为0、50、100、150和200 mg/L的ASIV,或0、100、200和400μmol/L的PA,细胞成像仪培养48 h后计数分析,观察ASIV和PA对RAW264.7细胞活力的影响。再将RAW264.7细胞分为对照组、PA(200μmol/L)组和PA(200μmol/L)+ASIV(100 mg/L)组。油红O染色观察RAW264.7细胞脂质沉积情况;细胞免疫荧光染色观察RAW264.7细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(gluta⁃thione peroxidase 4,GPX4)及铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)的蛋白表达水平;RT-qPCR和Western blot测定GPX4、FTH1、P53和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的mRNA和蛋白表达水平;活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光探针检测各组RAW264.7细胞ROS水平。结果:细胞成像仪筛选出200μmol/L和100 mg/L分别为后续实验中PA和ASIV的相对最佳浓度。与对照组相比,PA组细胞核缩小且不清晰,细胞质内可见弥漫性橘红色脂滴;细胞免疫荧光结果显示,PA组GPX4和FTH1蛋白平均荧光强度显著降低(P<0.01);PA组P53表达显著增加(P<0.05),SLC7A11、GPX4和FTH1表达均显著减少(P<0.05);PA组ROS水平显著增高(P<0.05)。与PA组相比,PA+ASIV组细胞核部分恢复正常,细胞质内橘红色脂滴减少;PA+ASIV组GPX4和FTH1蛋白平均荧光强度显著升高(P<0.01);PA+ASIV组P53表达显著降低(P<0.05),SLC7A11和GPX4表达显著增加(P<0.05),FTH1蛋白表达未见显著差异(P>0.05);PA+ASIV组ROS水平显著降低(P<0.05)。结论:ASIV能够抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞的脂质沉积,可能与调控铁死亡相关因子表达有关。

黄芪多糖及黄芪甲苷对巨噬细胞吞噬结核杆菌作用的研究

目的:探讨黄芪多糖或黄芪甲苷对巨噬细胞吞噬结核杆菌作用的影响。方法:将不同浓度黄芪多糖或黄芪甲苷小鼠腹腔巨噬细胞及结核杆菌共同孵育,检测巨噬细胞对结核杆菌的吞噬能力,并检测培养液中IFN-γ和IL-1β的含量。结果:当黄芪多糖或黄芪甲苷的给药量分别为0.2、0.6、1.5、4μg/μl时,巨噬细胞吞噬结核杆菌的TB-DNA拷贝数以及上清液中IFN-γ和IL-1β的含量均明显高于对照组。结论:黄芪多糖或黄芪甲苷均提高巨噬细胞对结核杆菌的吞噬作用,并以黄芪甲苷效果更佳,但它们均具有双相性。

黄芪甲苷、β-榄香烯增强小鼠巨噬细胞免疫功能的体外实验研究

目的观察黄芪甲苷、β-榄香烯对小鼠巨噬细胞(Mφ)免疫功能的影响,为阐明黄芪、莪术的抗肿瘤机制提供实验依据。方法黄芪甲苷、β-榄香烯体外作用小鼠Mφ细胞株J447A.1细胞,用流式细胞仪检测其表面分子(MHCⅡ、MHCⅠ、CD40、CD86),吞噬中性红实验检测Mφ的吞噬能力。结果经黄芪甲苷、β-榄香烯处理,J447A.1细胞表面MHCⅡ、MHCⅠ、CD40、CD86分子的表达水平均高于空白组。其中黄芪甲苷组MHCⅠ水平明显高于空白组(P<0.05);β-榄香烯组CD40表达明显高于空白组(P<0.05);黄芪甲苷联合β-榄香烯组MHCⅡ、CD86表达明显高于空白组(P<0.05)。黄芪甲苷作用12h后,Mφ吞噬中性红的能力明显高于正常对照组(P<0.05);β-榄香烯作用24h后,Mφ吞噬中性红的能力明显高于正常对照组(P<0.05),尤以100μg/ml的作用浓度最佳;经黄芪甲苷与β-榄香烯联合作用后,Mφ吞噬中性红的能力明显高于正常对照组(P<0.05)。结论黄芪甲苷、β-榄香烯及其联用能增强Mφ表面MHC分子和免疫共刺激因子表达,促进Mφ的吞噬能力。

黄芪甲苷促M2型巨噬细胞极化的作用研究

目的探讨黄芪甲苷对M2型巨噬细胞极化的影响。方法黄芪甲苷体外作用小鼠原代巨噬细胞,用流式细胞仪检测其表面分子(CD206、MHCII和CD80/86)表达,Real time-PCR检测M1/M2型巨噬细胞特征基因(i NOS、YM1和Arg1)的表达,ELISA测定炎症相关细胞因子(TNF-α、IL-6、TGF-β)的表达。结果黄芪甲苷单独处理未能诱导M2型巨噬细胞生成,但其与IL-13联合处理可明显上调M2型巨噬细胞标志CD206、YM1和Arg1的表达,下调抗原提呈相关分子MHCII和CD80/86的表达,促进抑炎细胞因子TGF-β的分泌。结论黄芪甲苷通过协同作用方式促进M2型巨噬细胞极化。

巨噬细胞移动抑制因子在病毒性心肌炎中的作用及黄芪甲苷干预研究

目的:探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在病毒性心肌炎(VM)小鼠中的表达及黄芪甲苷的干预作用。方法:55只雄性Balb/c小鼠随机分为正常对照组(A组,n=10)、模型对照组(B组,n=15)、低剂量干预组(C组,n=15)及高剂量干预组(D组,n=15)。后3组经腹腔接种柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发急性心肌炎,C组和D组于病毒接种后当天分别以1%、9%黄芪甲苷0.1mL灌胃,A组和B组均以羧甲基纤维素钠溶液灌胃,1次/d,连续14d。第15天处死全部存活小鼠并取其心脏,采用RT-PCR和免疫组化等方法半定量分析各组小鼠心肌组织中MIFmRNA及蛋白质表达水平。结果:A、B、C、D组小鼠死亡率分别为0%、46.7%、40.0%和13.3%,D组死亡率明显低于B组和C组(P<0.05),B组和C组之间无显著性差异。B组心肌MIFmRNA及蛋白质表达水平均明显高于A组(P<0.05),D组MIFmRNA和蛋白质表达水平较B、C组显著降低(P<0.01),而C组与B组比较差异无显著性。结论:MIF参与VM发病过程,黄芪甲苷对VM的治疗作用可能与其下调MIF表达有关。

二甲双胍激活AMPK通路减轻饱和脂肪酸诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的观察二甲双胍对饱和脂肪酸(SFA)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应中炎性因子的影响及探讨其可能机制。方法 SFA干预RAW264.7巨噬细胞建立体外炎性反应模型;实验分为对照组、SFA干预组、二甲双胍+SFA干预组、AMPK抑制剂Compound C+二甲双胍+SFA干预组;实时定量PCR检测TNF-α和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测TNF-α和IL-6蛋白的分泌,Western blot分析腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平。结果与对照组比较,SFA干预组RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6 mRNA表达及蛋白分泌水平均显著升高(P<0.05);与SFA组比较,二甲双胍+SFA干预组TNF-α、IL-6 mRNA表达水平及蛋白分泌水平均降低(P<0.05),而细胞AMPK的磷酸化水平增强(P<0.05);与二甲双胍+SFA干预组比,Compound C+二甲双胍+SFA干预组TNF-α、IL-6 mRNA表达及蛋白分泌水平均升高,AMPK磷酸化水平降低(P<0.05)。结论二甲双胍激活AMPK降低饱和脂肪酸诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-6的分泌。

黄芪甲苷通过促进小胶质细胞/巨噬细胞M2型极化抑制大鼠脑缺血后炎症反应

目的:研究黄芪甲苷对大鼠脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化及炎症反应的影响。方法:将48只大鼠随机分为手术对照组、模型对照组和黄芪甲苷组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型。黄芪甲苷组造模后即刻腹腔注射黄芪甲苷(40 mg/kg),随后1次/d,连续给药3 d。各组术后第1、3天采用改良的神经损伤严重程度评分(mNSS)和角试验进行神经功能评价;术后第3天采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染料(TTC)染色检测脑梗死体积;实时逆转录PCR检测M1型小胶质细胞/巨噬细胞表面标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,以及M2型小胶质细胞/巨噬细胞表面标志物CD206、精氨酸酶1(Arg-1)、类几丁质酶3样分子1/2(YM1/2)及抗炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达;免疫荧光双标记法检测脑缺血周边区CD16/32/Iba1和CD206/Iba1的表达。结果:与模型对照组比较,黄芪甲苷组mNSS分值降低、右转次数减少(P<0.05或P<0.01),脑梗死体积减小(P<0.01),M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调(均P<0.01),M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD206、Arg-1、YM1/2、IL-10和TGF-β的mRNA表达上调(均P<0.01),脑缺血区CD16/32^+/Iba1^+细胞数量减少(P<0.05),CD206^+/Iba1^+细胞数量增加(P<0.01)。结论:黄芪甲苷对大鼠脑缺血损伤有保护作用,可能与促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型向M2型转化、抑制炎症反应有关。

冬凌草甲素对LPS诱导Raw264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用

目的研究冬凌草甲素对脂多糖(LPS)诱导的Raw264.7巨噬细胞炎症反应的影响。方法选用小鼠巨噬细胞Raw264.7,CCK-8法确定冬凌草甲素作用的最适浓度;设立正常对照组、模型对照组(LPS组)、实验组(冬凌草甲素预处理+LPS组)和阳性药组(地塞米松预处理+LPS组),实时定量PCR法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TLR4 mRNA表达水平的改变;Western blot法检测NF-κB p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平的改变。结果冬凌草甲素作用于Raw264.7细胞的最佳浓度为10μmol/L;与LPS组比较,冬凌草甲素预处理实验组Raw264.7细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平明显下降,IL-10 mRNA表达水平明显升高,TLR4基因表达降低,NF-κB活化入核减少。结论冬凌草甲素能下调LPS诱导的Raw264.7细胞促炎因子表达,其抗炎免疫作用机制与抑制TLR4-NF-κB信号通路的活化有关。

黄芪甲苷降低结肠巨噬细胞比例减缓溃疡性结肠炎发生发展

目的:观察黄芪甲苷(AS-Ⅳ)在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)中的保护作用并初步探究其保护机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组和AS-Ⅳ组,AS-Ⅳ组连续灌胃给予AS-Ⅳ(100 mg/kg)7 d。证实AS-Ⅳ对小鼠体质量和结肠长度均无影响后,将雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组、DSS组、DSS+AS-Ⅳ组,DSS组小鼠自由饮用2.5%DSS水溶液7 d,DSS+AS-Ⅳ组小鼠自由饮用2.5%DSS水溶液的同时连续灌胃给予AS-Ⅳ(100 mg/kg)7 d。HE染色观察小鼠结肠组织病理变化;qRT-PCR检测小鼠结肠组织细胞因子mRNA表达;流式细胞术检测小鼠外周血和结肠固有层单核/巨噬细胞比例。结果:与Control组相比,AS-Ⅳ组小鼠体质量和结肠无明显变化,DSS组小鼠体质量明显减轻、结肠长度缩短,肠黏膜组织结构破坏,炎症细胞浸润增多,结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2、CCR2 mRNA表达显著升高;与DSS组相比,DSS+AS-Ⅳ组小鼠结肠缩短程度和结肠组织炎症细胞浸润水平降低,Ly6C+MHCⅡ-巨噬细胞和外周血炎症性单核细胞比例降低,结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2、CCR2 mRNA表达显著降低,而结肠组织IL-10、TGF-β mRNA表达显著升高。结论:AS-Ⅳ通过降低DSS诱导的UC小鼠结肠固有层中Ly6C+MHCⅡ-巨噬细胞比例及炎症因子表达减缓了UC发生发展。

黄芪甲苷抑制U937巨噬细胞CCL18表达及其作用机制研究

目的研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)抑制组织细胞淋巴瘤细胞U937,刺激巨噬细胞分泌肿瘤促进因子CCL18表达及其作用机制。方法考察黄芪甲苷对白细胞介素4(IL-4)刺激巨噬细胞CCL18表达的影响;实时PCR检测CCL18mRNA表达水平;采用酶联免疫吸附检测(Elisa)法测定CCL18蛋白水平;流式细胞仪检测白细胞介素4受体(IL-4R)的表达水平;Elisa法检测信号传导及转录激活因子6(STAT6)磷酸化水平;采用Z″-LYTETM激酶检测法检测Janus激酶(JAK)活性。结果黄芪甲苷能显著抑制IL-4诱导的U937巨噬细胞CCL18表达上调,且呈明显的量效依赖性,但对IL-4受体组成亚基表达影响不显著;黄芪甲苷可抑制STAT6的磷酸化,但作用小于AS1517499;黄芪甲苷可抑制JAK1,JAK3和酪氨酸激酶2(TYK2)的活性。结论黄芪甲苷可抑制IL-4刺激的U937巨噬细胞CCL18的表达。其作用途径之一可能是通过抑制JAK激酶活性,引起STAT6的转录活性下调,从而抑制CCL18基因表达。

异荭草苷通过MAPK/FoxO信号通路减轻LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

为了研究异荭草苷(Isoorientin,ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL^(-1))和异荭草苷(ISO 2.5~40μg·mL^(-1)+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示,ISO显著抑制MAPK信号通路中p-JNK和p-p38的磷酸化,并减少Fox O1/3的核转位。综上所述,ISO可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应,其作用机制可能与其在MAPK/FoxO信号通路中发挥调节作用有关。

IL-17A通过上调ABCA1的表达减少RAW264.7巨噬细胞脂质的积聚

目的:探讨白细胞介素17A(IL-17A)对RAW264. 7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达的影响。方法:用不同浓度及的IL-17A处理小鼠RAW264. 7细胞6 h或24 h,或用同一浓度IL-17A处理RAW264. 7细胞不同时间;采用RT-qPCR及Western blot法检测细胞ABCA1的mRNA和蛋白表达情况;采用NBD-胆固醇法检测细胞胆固醇流出情况;采用油红O染色法测定细胞脂质蓄积情况。结果:与对照组相比,IL-17A可以增加RAW264. 7巨噬细胞ABCA1蛋白的表达水平,但不影响ABCA1 mRNA的表达。经IL-17A干预,RAW264. 7巨噬细胞内胆固醇向Apo A-1流出增多,同时细胞脂质蓄积显著减少(P <0. 01)。结论:IL-17A可以增加RAW264. 7巨噬细胞ABCA1的表达水平,其机制并不是通过转录水平实现的,这种影响可能与其抗动脉粥样硬化作用有关。

壬基酚异构体NP_(42)对小鼠RAW264.7巨噬细胞的损伤作用

目的:研究壬基酚异构体NP_(42)对小鼠巨噬细胞RAW264.7的损伤作用并探究其分子机制。方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,将不同浓度NP_(42)(0.1~100μmol/L)作用于细胞24 h,采用噻唑蓝法检测细胞存活率,酶联免疫分析检测环磷酸鸟苷(cGMP)和环磷酸腺苷(cAMP)含量,RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达水平,Western blot法检测蛋白激酶C(PKC)的表达情况以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化水平。结果:0.1~10μmol/L NP对细胞存活率无显著影响,100μmol/L NP_(42)能显著降低RAW264.7细胞的存活率(P <0.01)。与对照组相比,NP_(42)处理24 h能显著抑制细胞TNF-α mRNA和iNOS mRNA的表达,抑制细胞PKC蛋白的表达和降低细胞内cAMP的含量,同时增强细胞内c GMP的含量。NP_(42)处理能显著下调p38的磷酸化水平。结论:壬基酚异构体NP_(42)通过PKC-cAMP信号通路以及p38-MAPK信号通路对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生损伤作用,这可能是壬基酚发挥免疫损伤的主要分子机制。

miRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达

目的构建miR-144真核表达载体,检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达。方法结合文献,通过预测软件分析,选取评分较高、可作用于ABCA1 mRNA 3'非编码区(ABCA1 mRNA3'UTR)的miR-144。通过分子克隆技术,利用PCR扩增miR-144和ABCA1 mRNA 3'UTR的DNA序列,酶切胶回收后,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1(+)-luciferase载体上。测序后,运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性,观察miR-144是否对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用。运用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞。通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量。通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化。结果 miR-144 PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体上,ABCA1 mRNA 3'UTR连接至pcDNA3.1(+)-luciferase载体上,测序正确。运用双荧光素酶报告基因系统检测发现,和对照组[pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者相比,实验组[pcDNA3.1(+)-miR144、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性(P<0.05),证明miR-144对ABCA1 mRNA3'UTR具有直接靶向作用。将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中,qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体组miR-144表达无明显变化(P>0.05);转染pcDNA3.1(+)-miR-144组中miR-144表达量显著增高(P<0.01).qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)-miR-144对ABCA1 mRNA表达水平无明显影响(P>0.05),Western blot结果显示转染pcDNA3.1(+)-miR-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达(P<0.01)。结论 miR-144可以在转录后水平降低ABCA1蛋白的表达。

黄芪对脂多糖活化小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的研究黄芪经水提醇沉所得提取物及黄芪甲苷对脂多糖(LPS)活化小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞产生一氧化氮(NO)的影响作用,并测定提取物中黄芪甲苷的含量。方法小鼠三磷腺苷荧光试剂盒(ATPliteTM)测定黄芪提取物及黄芪甲苷对RAW 264.7细胞的毒性作用,Griss法测定样品对LPS活化RAW 264.7细胞后细胞培养液中亚硝酸盐(NO2-)的含量间接反映NO生成量,姜黄素为阳性对照。液相色谱仪测定提取物中黄芪甲苷的含量。结果黄芪提取物在200~400μg·mL-1、黄芪甲苷在10~20μg·mL-1的剂量范围内均表现出显著抑制NO生成的作用(P<0.05)。每1 mg提取物中含6.1μg黄芪甲苷,400μg·mL-1提取物的抑制作用(其中含黄芪甲苷2.4μg·mL-1)与20μg·mL-1的黄芪甲苷相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论黄芪具有抑制LPS活化小鼠巨噬细胞产生NO的作用,黄芪甲苷为其效应成分之一。

黄芪提取物作用于巨噬细胞的研究进展

黄芪作为补气要药,其调节免疫的作用已经广为接受。黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮类成分是黄芪的有效成分。现代研究表明黄芪有调节免疫、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖等作用,其中起到重要作用的巨噬细胞参与发挥,文章就巨噬细胞如何参与黄芪发挥作用进行阐述。

黄芪甲苷调控外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN通路抗结直肠癌肝转移机制研究

目的研究黄芪甲苷(ASⅣ)抑制结直肠癌肝转移的作用机制,探索ASⅣ对外泌体介导的Jumonji结构域包含蛋白3(JMJD3)/第27位的赖氨酸三甲基化的组蛋白H3(H3K27me3)/骨桥蛋白(OPN)信号通路的影响。方法取对数生长期的MC38细胞,超速离心法提取MC38细胞外泌体(MC38-EVs)及ASⅣ干预后MC38细胞外泌体(ASⅣ/MC38-EVs),粒径鉴定后用于动物实验。选取C57BL/6J小鼠15只,建立结直肠癌原位肝转移模型后,按照随机数字表法分为模型组、MC38-EVs组、ASⅣ/MC38-EVs组,每组5只。模型组造模前1周尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS),100μL/次,隔日1次,连续3周;MC38-EVs组和ASⅣ/MC38-EVs组造模前1周尾静脉分别注射0.1 g/L的MC38-EVs、ASⅣ/MC38-EVs,100μL/次,隔日1次,连续3周。4周后处死小鼠,观察结直肠癌肝转移情况;苏木精-伊红(HE)染色法观察肝转移灶病理学改变;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达情况;免疫荧光法检测肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞的浸润和JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测瘤体中JMJD3、OPN mRNA表达。结果与模型组比较,MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显增加(P<0.05);与MC38-EVs组比较,ASⅣ/MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显减少(P<0.05);免疫荧光结果显示,与模型组比较,MC38-EVs组中肝组织F4/80+、CD206+巨噬细胞浸润程度明显升高(P<0.05);与MC38-EVs组比较,ASⅣ/MC38-EVs组中肝组织巨噬细胞浸润程度明显降低(P<0.05);Western blot、RT-qPCR和免疫荧光结果显示,与模型组比较,MC38-EVs组JMJD3、OPN蛋白和mRNA表达水平明显升高(P<0.05),H3K27me3蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与MC38-EVs组相比,ASⅣ/MC38-EVs组JMJD3、OPN蛋白和mRNA表达水平明显降低(P<0.05),H3K27me3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论ASⅣ能够有效抑制结直肠癌肝转移,其机制与调控外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN通路激活相关。