中国黄褐孢一新变种

报道了褐孢属ＦｕｌｖｉａＣｉｆｅｒｒｉ一新变种，黄褐孢缢缩变种（Ｆｕｌｖｉａｆｕｌｖａｖａｒ．ｃｏｎ－ｔｒｉｃｔａＺ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｔ．Ｆ．ＬｉｅｔＨ．Ｚｈａｎｇ），有中文和拉丁文描述及形态图．模式标本收藏于云南农业大学真菌标本室（ＭＨＹＡＵ）

培养条件对褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的影响

对褐黄孢链霉菌摇瓶发酵合成纳他霉素的研究表明: 种龄、接种量和装液量对纳他霉素合成的影响显著;在实验范围内,随着种龄、接种量和装液量的增加,纳他霉素产量均表现出先增加后减少的趋势,而菌体干重则变化很小.最适宜产物合成和菌体生长的发酵培养基初始pH值各不相同,分别为7.5～8.0和6.5～7.0.当发酵温度从31℃下降到25℃时,纳他霉素产量大幅度增加,而菌体干重在31℃达到最大值.在种龄48 h、接种量10%、25℃、初始pH值 7.6、装液量10%的优化条件下,纳他霉素最高产量达到1.5 g/L, 基于菌体干重的产率为4.917%.

褐黄孢链霉菌纳他霉素发酵条件优化

采用Plackett-Burman设计(Plackett-BurmanDesign,P-B)对影响褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC13326纳他霉素发酵的相关因素进行了评价,所选取的15个因素为可溶性淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、酵母抽提物、蛋白胨、牛肉膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、CaCO3、种龄、接种量、装液量、初始pH值和发酵温度。在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用中心旋转组合设计及响应面分析对影响纳他霉素产量的关键因素初始pH、发酵温度、KH2PO4、CaCO3、酵母抽提物、蛋白胨和种龄的最佳水平范围作进一步的研究和探讨,通过拟合得到了响应曲面函数,但该函数的驻点是鞍点,因此不具有全局的最大、最小值。最后通过约束优化得到较佳的实验点,在该实验点条件下纳他霉素的产量比基本培养条件下提高了2倍,达到4.5g?L?1。

高产纳他霉素的褐黄孢链霉菌选育

目的 以褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus) S- 71为出发菌株 ,筛选纳他霉素的高产菌株。方法 紫外线对孢子悬浮液照射 4 0 s后 ,分别用链霉素抗性和琼脂块法进行筛选纳他霉素高产菌株 ,之后对高产菌株进行生产稳定性实验。结果 通过链霉素抗性法筛选获得了约 10 %的正选率突变株 ,其中突变株SG- 5 6摇瓶效价单位为 2 4 10μg/ ml,为出发菌株的 14 6 % ;通过琼脂块筛选法获得了约 1%的正选率突变株 ,其中突变株 SG- 2 0 0 2摇瓶效价单位为 2 6 5 0μg/ ml,为出发菌株的 16 1% ,该菌株无链霉素抗性标记。结论 链霉素抗性筛选和琼脂块筛选均可以获得纳他霉素的高产菌株 ,其中链霉素抗性筛选法效率高 ,琼脂块法筛选全面。

金属离子对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响

【目的】研究不同金属离子对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响。【方法】用单因素摇瓶发酵试验方法,研究不同浓度Na+,Fe2+,Mg2+,K+,Ca2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+和Co2+对褐黄孢链霉菌生长和纳他霉素生物合成的影响。【结果】在发酵培养基中添加Mg2+和Ca2+可促进褐黄孢链霉菌的菌体生长,添加Fe2+、Cu2+、Mn2+和Co2+可抑制菌体生长,而添加Na+、K+和Zn2+对菌体生长无显著影响;在发酵培养基中添加低浓度K+、Ca2+和Co2+可促进纳他霉素的生物合成,添加Na+、Fe2+、Cu2+和Zn2+抑制纳他霉素的生物合成,而添加Mg2+和Mn2+对纳他霉素的生物合成无显著影响。【结论】不同种类、不同浓度的金属离子,对褐黄孢链霉菌菌体生长和纳他霉素生物合成的影响差别较大;在培养基中添加适当浓度和种类的金属离子,有助于提高纳他霉素的产量。

褐黄孢链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

考察了双亲灭活条件、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、PEG浓度、融合时间、融合温度及无机离子浓度对褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)SG-2002-1和SG-2002-2原生质体融合率的影响。分别采用紫外灭活和热灭活法,灭活条件为紫外灭活2 min,热灭活为60℃水浴1 h。原生质体融合最佳条件为:50%的PEG 6000,融合温度25℃,融合时间为8 min,CaCl2浓度为0.05 mol/L,MgCl2浓度为0.02 mol/L,在此条件下融合率可达5.0%。

褐黄孢链霉菌原生质体制备与再生

以纳他霉素产生菌株褐黄孢链霉菌SG-2002为出发菌株,考察了菌丝体培养基、甘氨酸浓度、培养时间、溶菌酶浓度、酶解温度、酶解时间及再生培养基对原生质体形成与再生的影响。原生质体形成和再生的最佳条件为S培养基中添加1%的甘氨酸,菌丝体培养30h,溶菌酶浓度40mg/(g菌体干重),酶解温度30℃,酶解时间60min。褐黄孢链霉菌的原生质体形成量达到4.0×106个/mL,再生培养基选择R5′培养基,再生率为9.0%。

响应面优化褐黄孢链霉菌原生质体再生培养基

本实验以再生率作为考察指标,采用单因素和响应面法优化了褐黄孢链霉菌原生质体再生培养基中的三种成分,确定其最佳浓度组合为:磷酸二氢钾0.13g/L、L-脯氨酸5.48g/L、聚乙烯吡咯烷酮0.18g/L。在优化后的再生培养基中原生质体再生率达到17.2%,与模型预测值16.7%拟合较好。结果表明,响应面法是优化原生质体再生培养基的一种有效方法。

褐黄孢链霉菌高产纳他霉素的诱变选育

采用紫外线及微波对纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus,SG-71)进行诱变,并结合链霉素抗性筛选选育高产菌株。原始菌株经活化后,分别采用紫外线照射SG-71孢子悬液25 s、800 W微波处理30 s进行诱变,以链霉素选择培养基筛选纳他霉素高产菌株。通过链霉素抗性筛选获得了136株链霉素抗性突变株,其中正突变株SGUM33的纳他霉素产量达到2.47 g/L,较出发菌株提高了1.59倍。表明紫外线及微波诱变结合链霉素抗性筛选对产纳他霉素的链霉菌菌株能进行有效的选育,且筛选的菌株遗传性状稳定。

液态烷烃氧载体对褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的影响

利用单因素摇瓶发酵的实验方法,以多种液态烷烃作为氧载体,分别研究了其不同添加浓度、添加时间对褐黄孢链霉菌生长及对纳他霉素生物合成的影响。实验结果表明,正己烷、正十二烷和正十六烷都不能作为碳源被细胞利用,是有效的氧载体。正十二烷作为氧载体效果较好:接种同时添加6%的正十二烷培养,细胞干重和纳他霉素含量分别比对照组提高了22.9%和46.4%;而最佳添加时间为发酵后24 h,纳他霉素含量比接种同时添加提高了7.0%。添加6%的正十六烷,纳他霉素含量比对照组提高了43.3%。添加高于3%浓度的正己烷,菌体干重和那他霉素产量均低于对照组,推测可能是正己烷对细胞产生毒性而抑制了菌体生长和纳他霉素的合成。

引入血红素生物合成基因对褐黄孢链霉菌产纳他霉素的影响

目的考察引入血红素合成关键基因对褐黄孢链霉菌生产纳他霉素的影响。方法运用PCR方法扩增相关血红素合成基因hem A1、hem B、hem E,使用属间接合转移的方法转化入褐黄孢链霉菌HCCB13086,获得引入血红素基因的工程菌株;通过摇瓶发酵考察突变菌株对载氧能力及纳他霉素产量的影响。结果成功构建3个引入血红素合成关键基因的菌株,3株菌在相对高氧条件下生长及产抗能力均与对照组相当,而在相对低氧条件下纳他霉素产量均较对照菌株提高,其中引入hem A1血红素基因的菌株提高最为显著,较对照组的纳他霉素产量提高64%,达到8.52 g/L。结论引入血红素合成基因可提高菌体对氧的利用,促进菌体生长和代谢产物的增加。

褐黄孢链霉菌生产纳他霉素工艺条件研究

目前，国内纳他霉素产量低，为提高其产量，实现其工业化生产，主要对褐黄孢链霉菌ATCC13326发酵生产纳他霉素的培养条件及前体添加策略进行研究．得出最佳培养条件为：培养温度28℃，种龄40～44h，接种量10％，装液量10％，初始pH7．3，发酵24h时加入0．6％的前体丙酸钠．在此条件下摇瓶分批发酵生产纳他霉素的产量可达到6．87g／L，比未添加前体的纳他霉素产量（3．72g／L）提高了84．7％．利用10L发酵罐进行纳他霉素的发酵研究，在最优培养条件下，发酵罐中的纳他霉素产量可达到8．34g／L，比摇瓶分批发酵生产纳他霉素产量（6．87g／L）提高了21．4％．

响应面法优化褐黄孢链霉菌ZM701产纳他霉素发酵培养基

为了提高褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ZM701生产纳他霉素的产量,该文通过单因素试验,研究碳源、氮源及无机盐对菌体生长和纳他霉素产量的影响,采用响应面分析法优化发酵培养基中葡萄糖、豆粕、CaCO_3的添加量。结果表明,褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)ZM701产纳他霉素最佳发酵培养基组成为:葡萄糖52.6 g/L,酵母蛋白胨3.0 g/L,豆粕23.3 g/L,MgSO_4·7H_2O 2.0 g/L,CaCO_3 3.2 g/L。在此条件下,纳他霉素产量达到5.41 g/L,比优化前提高了77.8%。

褐黄孢链霉菌高产纳他霉素菌株的诱变选育

以褐黄孢链霉菌株(Streptomyces gilvosporeus)SG-17为出发菌株,依次利用紫外线、微波和Co60-γ射线进行诱变处理。通过致死率与诱变剂量的相互关系,确定最佳诱变剂量。采用80 s的紫外线照射、微波处理50 s、剂量为1.5 kGy的γ射线对褐黄孢链霉菌株S-17依次进行诱变,获得1株褐黄孢链霉突变菌株γ-188,突变株产纳他霉素的能力显著提高,发酵效价达到4.58 g/L,较出发菌株SG-17提高了1.45倍。紫外线、微波和Co60-γ射线三者的协同诱变效果好,突变株稳定性和产纳他霉素情况良好。

褐黄孢链霉菌WZ-18产纳他霉素发酵条件的优化

为确定产纳他霉素的褐黄孢链霉菌WZ-18的最佳发酵培养条件,研究了褐黄孢链霉菌菌株WZ-18产纳他霉素的发酵培养基成分及培养条件。结果表明:最佳培养基成分为葡萄糖40g/L、大豆蛋白胨20g/L、酵母粉7g/L、0.2%的磷酸镁,同时发酵48h时添加0.2%的丙酸钠;最佳培养条件为温度29℃、初始pH8.0、装液量40mL/300mL、接种量6%、转速200r/min;在此条件下培养,纳他霉素产量达到3.51g/L。

褐黄孢链霉菌基因组DNA的提取及RAPD体系的优化

以改进的SDS法提取褐黄孢链霉菌基因组DNA,对其进行随机扩增多态性(RAPD)研究。通过单因素和正交试验相结合的方法,建立了适于褐黄孢链霉菌RAPD分析的PCR反应体系:包括Taq聚合酶、Mg^(2+)、随机引物、dNTPs和模板浓度。在20μl体系中,模板DNA浓度60~150mg,Taq聚合酶为1.0~1.5U,引物浓度0.3~0.4mmol/L,dNTPs浓度200~250μmol/L,Mg^(2+)浓度2.5~3.0mmol/L。在此反应体系下可扩增出条带数目多且清晰稳定的电泳图谱。

纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素(natamycin)高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus TUST01)作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量(5.95 g/L)与生物量(29.19 g/L)较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现:通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34 mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。

中国茄子绒菌斑病病原菌的订正

在我国文献中茄子绒菌斑病(叶霉病)病菌为黄褐孢Fulviafulva,与番茄叶霉病菌相同。但是我们发现两者在菌丝体形态、分生孢子大小和细胞数目方面有显著差异,参考国外相关报道,认为茄子绒菌斑病病菌应为灰毛茄菌绒孢Mycovellosiellanattrassii而非黄褐孢。

链霉素抗性突变——纳他霉素高产菌株的选育研究

应用链霉素抗性筛选法 ,将经过紫外线诱变处理的纳他霉素生产菌———褐黄孢链霉菌 (Streptomycesgilvosporeus)ATCC1 332 6的孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度 (0 6μg mL)的培养基平板上 ,获得了 1 2 2株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有1 3株 ,产量阳性效率达到 1 0 6 % ,同时获得了产抗生素能力为出发菌株 1 46倍的突变株SG 56。