耐受性黄酒酵母YS6.2.5的选育及初步应用

黄酒酵母的耐受性对黄酒酿造至关重要。对原始菌株YS分别采用乙醇-热冲击法、细胞紫外诱变法和原生质体紫外诱变法,结合高温驯育进行选育,筛选到一株在38℃能正常生长发酵的黄酒酵母突变株YS6.2.5。YS6.2.5体积小,近似圆形,产香好,产酸少,30℃时产酒精能力、酒精耐性、高糖耐性分别为9.0%、19%、30°Bx,38℃时相应指标分别为6.5%、20%、28°Bx。酿酒实验表明,其生理耐性强,酿酒性能好,遗传性状稳定,具有较好的工业应用前景。

YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。

黄酒酵母发酵过程中产尿素的变化规律研究

本论文采用二乙酰肟比色法测定了黄酒酵母发酵过程中产尿素的规律。结果显示:黄酒酵母在生长过程中,分泌大量尿素到胞外,在稳定期(培养第51 h)胞外尿素浓度达38.642 mg/L,胞内尿素浓度(培养第27 h)为6.043 mg/L。培养基初始pH3,4时,相对初始pH=5而言酵母细胞的尿素的胞外分泌较少;培养基酒精浓度为12%时,酵母胞外尿素分泌水平下降;培养温度升高胞外尿素分泌水平下降。酶制剂代替麦曲的黄酒发酵实验结果显示,发酵液中尿素含量水平随着发酵进程而升高。

复合诱变选育低产尿素黄酒酵母

通过He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变黄酒酵母HJ1615,从中筛选分离得到4株产尿素量远低于亲株的新菌株。对这4株突变株进行发酵栓实验,并测定其发酵综合性能,其中菌株HJ1615-d4在发酵力、总酸、酒精度以及风味物质等综合指标方面保持了亲株的优良性状,同时产尿素的量为15.41mg/L,低于出发菌株产尿素量50%以上。通过5代以上发酵实验,其遗传性状稳定。

辣蓼草对机械化黄酒酵母菌的影响研究

添加不同量的辣蓼草对机械化黄酒酵母菌株的发酵特性进行研究。试验结果表明,在一定范围内添加辣蓼草对机械化黄酒酵母质量具有良好的促进作用。

黄酒酵母菌发酵特性的研究

为了确保黄酒的质量，对退化的黄酒酵母进行纯化复壮，并对复壮后酵母菌株的发酵特性进行了研究。试验结果表明：复壮后的酵母菌株发酵力和生长速度均高于原始菌株，适宜的培养时间是24h，发酵pH值为4．5—6．0。

耐受性黄酒酵母YS6.2.5生物转化铁的工艺优化

通过耐铁实验及铁驯化实验研究耐受性黄酒酵母YS6.2.5转化铁的特性,通过摇瓶实验及发酵罐放大实验研究YS6.2.5转化铁工艺。结果表明:YS6.2.5具有较强的耐铁能力及转化铁潜力,500mL三角瓶摇瓶优化工艺为:接种量10%、装液量40%、初始Fe2+质量浓度1000mg/L、培养时间24h、初始pH4.0、培养温度28℃、摇床转速200r/min,培养结束生物量为(14.68±0.37)g/L,细胞铁含量为(30.15±0.70)mg/g;以摇瓶实验为基础,采用50L培养罐中试放大,调整接种量15%、装液量60%,在对数生长初期2h内恒速流加Fe2+,培养18h,总铁含量最高达674.79mg/L,是摇瓶培养的1.52倍,富集率为67.48%,有机化程度为97.81%,转化率为66.00%。

黄酒酵母HO基因的敲除及其对黄酒发酵的影响

为对黄酒酵母菌株的遗传学进行研究,对黄酒酵母利用基因敲除技术敲除HO基因,通过Mcclary产孢培养基于25℃条件下培养5~7 d,得到a和α两种不同配型且配型不会发生转变的黄酒酵母单倍体菌株,通过群体杂交,成功获得了全敲除HO基因的二倍体酿酒酵母菌株黄酒酵母11-1-HOΔ,用于黄酒发酵实验。结果表明:通过基因工程手段敲除HO基因对黄酒发酵无显著影响,可用于工业生产中,且黄酒酵母11-1-HOΔ具有代表性,获得的单倍体是进一步研究黄酒酵母遗传基础和代谢机制的重要材料。

不同营养添加物对黄酒酵母的乙醇耐受及发酵性能的影响

通过乙醇定向驯化获得1株可耐受乙醇体积分数为20%的黄酒酿酒酵母Et 20。研究了不同浓度的脂肪酸、氨基酸、无机盐离子、海藻糖和肌醇对Et 20乙醇耐受性及发酵性能的影响。几种添加物都能不同程度地提高Et 20的乙醇耐受性及发酵性能。不同添加物对提高Et 20的乙醇耐受性效果如下:脂肪酸>氨基酸>无机盐>海藻糖>肌醇;对发酵性能的促进作用则是:海藻糖>脂肪酸>氨基酸>无机盐>肌醇。10%乙醇胁迫下,添加海藻糖可提高39.04%的发酵强度,对提高菌株的乙醇耐受性则不突出,仅可提高15.81%的菌株生物量;促进发酵效果仅次于海藻糖的硬脂酸不仅可提高26.13%的发酵强度,还可提高40%的菌株生物量。

黄酒酵母ADH2、ALD2和ALD6基因敲除对黄酒中乙醛代谢的影响

以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株,研究分别敲除乙醛代谢相关酶的编码基因ADH2、ALD2和ALD6对乙醛代谢的影响。采用融合PCR技术分别构建乙醇脱氢酶编码基因ADH2敲除组件"ADH2S-URA3-ADH2X"和乙醛脱氢酶编码基因ALD2和ALD6敲除组件"ALD2S-URA3-ALD2X"和"ALD6S-URA3-ALD6X",转化N85尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后,以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标记,分别获得ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-A2(Δadh2)、2a-D2(Δald2)和2a-D6(Δald6)。分别将获得的工程菌与亲本菌株以及前期构建的丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株2a-P5(Δpdc5)进行实验室规模的黄酒发酵实验。结果表明,与亲本菌株2a相比,工程菌2a-A2发酵液中乙醛含量降低了7.14%,而2a-P5发酵液中乙醛含量降低了32.68%,说明工业黄酒酵母乙醛的生成存在糖代谢途径,并且乙醛主要由丙酮酸脱羧而来;工程菌2a-D2和2a-D6发酵液中乙醛含量与亲本相比分别增加了144.91%和88.87%,说明乙醛脱氢酶是黄酒中控制乙醛降解的关键酶,而且ALD2基因在乙醛转化为乙酸过程中发挥更关键的作用。

优良黄酒酵母单倍体的分离筛选

对黄酒酵母进行生孢培养,获得黄酒酵母遗传育种单倍体亲本,分离获得单倍体后确定单倍体配型(a/α)。通过单倍体菌株发酵力的测定,研究单倍体在胁迫条件下(高浓度酒精、高浓度糖和高浓度乳酸)的耐受能力,并进行了黄酒发酵实验。通过不同单倍体菌株耐受能力的比较和黄酒发酵酒样中残糖、酒精度以及乙酸乙酯和异戊醇含量的分析,筛选出优良的黄酒酵母遗传育种单倍体亲本a-3和α-1。

黄酒酵母的改良及对产物中尿素和氨基甲酸乙酯含量的影响

氨基甲酸乙酯(EC)是一种潜在致癌物,在黄酒发酵过程中尿素是它的前体物质。该研究通过紫外诱变和基因过表达筛选获得改良黄酒酵母菌种,并对黄酒产品的理化指标进行检测可知,与出发菌株相比,改造菌株的发酵性能和黄酒的出酒率、酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮和β-苯乙醇没有明显的差异,而诱变菌株JF501-A62发酵产物尿素含量降低了67%,EC含量降低了59%;基因过表达菌株JF501-B5发酵产物尿素含量降低了88%,EC含量降低了63%。两者均有很好的发酵性能,并取得了较好地降低产品中尿素含量、进而降低氨基甲酸乙酯含量的效果。与紫外诱变相比,基因过表达的改良方法获得了尿素含量更低的菌株,并贮存6个月之后产品中的EC含量更低。

黄酒酵母β-苯乙醇合成途径醇脱氢酶Ⅰ的异源表达及酶学特性

醇脱氢酶Ⅰ(Adh1p)是黄酒酵母艾利希途径最后合成β-苯乙醇的一个关键酶。为探究黄酒酵母Adh1p的差异及酶学特性,以工业生产菌株黄酒酵母HJ和模式菌株酿酒酵母S288C的基因组为模板,设计引物PCR扩增醇脱氢酶编码区基因ADH1,构建pET-28a(+)表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达获得Adh1p。通过超声破碎菌体后获取粗酶液,亲和层析纯化后获取纯酶,进而探究酶学特性。以苯乙醛为底物,酶活性测定表明:来自黄酒酵母的Adh1p^(HJ)纯酶的酶活(231.51 U/g)比来自酿酒酵母的Adh1p^(S288C)(203.48 U/g)高13.79%,且Adh1p^(HJ)的K_(m)值(0.524μmol/L)小于Adh1p^(S288C)的K_(m)值(0.759μmol/L),表现为Adh1p^(HJ)与底物的亲和力更大。从k_(cat)/K_(m)值发现Adh1p^(HJ)(0.406 L/(μmol·min))的催化效率更高。Adh1p^(HJ)耐受β-苯乙醇和乙醇的能力较高于Adh1p^(S288C)。本研究结果为Adh1p的结构以及酶学性质分析提供方法和理论依据,同时也对β-苯乙醇工业生产开发提供借鉴。

高产β-苯乙醇黄酒酵母的选育

黄酒中重要的风味物质β-苯乙醇主要由黄酒酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)代谢产生,提高黄酒酵母β-苯乙醇产量可显著提升黄酒风味。本研究以绍兴地区酿酒酵母为紫外诱变出发菌株,对紫外诱变菌株进行底物类似物抗性筛选、酒精耐受性筛选、黄酒模拟液筛选,得到可提高β-苯乙醇产量的正突变菌株,再经产孢纯化与筛选得正突变菌株BYC-3。在发酵体系不外源添加前体化合物情况下,正突变菌株BYC-3菌株β-苯乙醇产量达238.12 mg/L,是出发菌株的2.67倍,其产酒精能力与出发菌株没有显著性差异,可为高品质黄酒开发提供参考。

黄酒酵母的性能改良及降低其产物中氨基甲酸乙酯含量的研究

氨基甲酸乙酯(EC)是一种潜在致癌物,在黄酒发酵过程中尿素是它的前体物质。该研究通过紫外诱变和基因过表达筛选获得改良黄酒酵母菌种,并对黄酒产品的理化指标进行检测可知,与原始菌株相比,改造菌株酿造的发酵性能和黄酒的出酒率、酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮没有明显的差异,而诱变菌株JF501-A62发酵产物尿素含量降低了67%,EC含量降低了59%;基因过表达菌株JF501-B5发酵产物尿素含量降低了88%,EC含量降低了63%。两者均有很好的发酵性能,并取得了较好的降低产品中尿素含量、进而降低氨基甲酸乙酯含量的效果。与紫外诱变相比,基因过表达的改良方法获得了尿素含量更低的菌株,且贮存6个月之后产品中的EC含量更低。

不同温度和底物浓度下黄酒酵母Saccharomyces cerevisiae苏-25发酵过程建模与优化

温度在黄酒发酵过程中对黄酒的品质有着重要影响。目前尚没有建立关联黄酒发酵过程中温度对黄酒发酵影响的模型。本研究以黄酒发酵过程中的通用酵母Sacchaaaromyces cerevisiae苏-25为产酒精菌株,以葡萄糖为底物,系统研究了不同温度(22℃,26℃,30℃)和不同起始底物浓度(100 g/L,150 g/L)下,黄酒酵母发酵过程中底物浓度、酒精生成和生物量的动态变化,并建立了黄酒酵母发酵过程动力学模型,同时基于四阶龙格库塔法和最小二乘法模拟了不同情况下的发酵过程。结果表明,发酵初期较高的温度有利于细胞的生长,而产酒精阶段,较低的温度则有力与酒精的积累,本研究所建立的模型可以对试验数据较好的仿真拟合。该模型的建立为黄酒发酵过程的优化控制和批次稳定性提供了初步的理论基础。

黄酒酿造酵母耐受性能的研究

分析研究了4株黄酒工业常用的酿造酵母(HJ1、HJ2、HJ3和HJ4)在胁迫条件下(高浓度酒精、高浓度糖等)的耐受性能。结果表明,所测定菌株普遍都能耐受10%vol的酒精,其中HJ2表现出较强的耐受能力,而HJ1则最弱,其发酵失重仅为HJ2的62.6%;在40%的高糖浓度下,HJ1生长受抑制程度最小;除HJ1仅能耐受1.2 mol/L氯化钾的渗透压外,所有酵母都能在1.8 mol/L的高渗透压下生长,其中HJ4受抑制程度最小;在54 g/L的高浓度乳酸条件下,HJ3和HJ1表现出较强的发酵能力;HJ4营养饥饿耐受性最强,饥饿9 d后细胞仍有存活率。对清酒酵母(K-7)耐受性能的研究,发现其耐高浓度糖和高浓度乳酸能力明显较黄酒酵母要弱,在高糖浓度下其菌体浓度仅为HJ1的50.3%,而在高浓度乳酸下发酵总失重仅为HJ3的47.4%。

不同包埋量固定化酵母对黄酒发酵及风味的影响

通过使用不同包埋量的固定化酵母,进行黄酒发酵实验,探索发酵过程中黄酒的理化指标及风味物质的变化。以不同浓度酵母发酵液与1.5%的海藻酸钠及4%CaCl2溶液制成固定化酵母,进行黄酒发酵实验。结果表明,固定化酵母包埋量为1.0×107个/mL生成的酯类总量最高,发酵体系醇酯比较小(3.77),同时香气K值较大(12.87),香气强度大,在固定化条件下是理想的酵母包埋量。

黄酒酵母优良抗逆菌株的筛选、鉴定及发酵特性研究

从黄酒厂的麦曲、酒药、发酵醪中分离到52株菌株,通过比较这些菌株的耐乙醇和渗透压的能力,筛选出抗逆性强的菌株F-18。通过形态学、生理生化和rDNA ITS序列的系统发育分析,鉴定分离筛选到的菌株F-18为酿酒酵母,其进化关系与另两株分离自台湾与北京地区的酿酒酵母菌最近,表明它们之间可能有共同的地域起源。黄酒发酵试验结果表明:菌株F-18的起酵速度快,对糖的转化利用能力高,黄酒中总酸、高级醇等含量适中。菌株F-18为酿造优质黄酒的酵母菌株,具有进一步开发利用的价值。

浅谈酵母菌在机械化黄酒生产中的操作控制

黄酒酵母菌是机械化黄酒发酵的灵魂和命脉,关系到黄酒正常发酵与产品质量的稳定问题。保持黄酒酵母的良好性能应注意菌种保藏、酵母扩培、酒母制作等。菌种保藏以液体石蜡保藏法为最经济方便;酵母扩培尽量减少转接代数;酒母制备要做到以酸抑酸,这对黄酒质量的影响最大。