芹菜黄酮合成酶Ⅰ基因的克隆与序列分析

选用3个芹菜材料六合黄心芹、津南实芹和美国西芹,分别从中克隆了合成黄酮类化合物的关键酶基因——芹菜黄酮合成酶I基因(AgFS I)。该基因全长均为1 616 bp,含有359 bp的内含子I和190 bp的内含子II。芹菜AgFS I基因编码355个氨基酸,属于20G-FeII_Oxy超级家族。序列分析结果显示,3种芹菜中AgFS I基因在核苷酸水平上有5个碱基的差异,编码的氨基酸有5个位点的差异。芹菜黄酮合成酶I(AgFS I)与其他来源植物的FSI氨基酸多重序列比对分析结果表明,该酶具有高度保守性。对AgFS I进行进化树分析,氨基酸序列的疏水性/亲水性分析,三级结构预测与分析,结果显示AgFS I与同属于伞形科的胡萝卜和孜然芹的FSI进化关系最近,AgFS I属于疏水性蛋白质,3种芹菜AgFS I的空间结构相似。

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。

蒙古黄芪异黄酮合成酶基因密码子偏好性分析

异黄酮是只局限于豆科蝶形花亚科等极少数植物中的一种植物性雌激素,异黄酮合成酶(IFS)是苯丙氨酸分支代谢途径——异黄酮代谢途径的关键酶。为了解蒙古黄芪IFS基因密码子的使用特性,采用CodonW,SPSS软件及EMBOSS在线程序分析蒙古黄芪IFS基因密码子的偏好性,并分别与14个物种的IFS以及模式生物基因组进行比较。结果显示,蒙古黄芪IFS基因的密码子选择偏性较弱且较偏好以A/T结尾,而物种间IFS密码子选择偏性则存在一定差异;进化树分析表明,基于IFS编码序列聚类结果比密码子使用偏性分类结果能更准确地反映物种间的亲缘关系;密码子使用频率比较结果发现,酵母真核表达系统更适用于蒙古黄芪IFS基因异源表达系统建立,而蒙古黄芪IFS基因与模式植物基因组之间密码子使用偏性差异较小,尤其拟南芥可能为该基因转基因研究最为理想的受体。

异黄酮合成酶基因高表达的大豆转基因愈伤组织的研究

目的获得异黄酮合成酶基因高表达的转基因大豆愈伤组织。方法利用根瘤菌介导的大豆转基因方法,将异黄酮合称酶基因质粒pCAMB IA1301-C IP的T-DNA部分转入大豆基因组中并诱导转基因愈伤。结果利用GUS染色法,确认外源质粒片段基本表达良好;利用PCR及反转录PCR(RT-PCR)确定外源基因片段的插入及IFS基因的表达情况良好。结论利用根瘤菌介导的转基因体系,可将外源异黄酮合成酶基因转入大豆基因组中并实现其表达,可为开发利用大豆异黄酮,以及为大豆异黄酮生物合成与调控研究提供依据。

忍冬属黄酮合成酶基因FNSⅡ密码子偏好性及进化分析

目的探讨忍冬属木犀草苷关键合成酶基因FNSⅡ在进化过程中形成的密码子使用模式及其与不同植物的亲缘关系,为实现木犀草苷异源高表达提供依据。方法利用Codon W、Clustal X、MEGA4.0及SPSS18.0软件,对23个不同物种的FNSⅡ基因及29条忍冬属FNSⅡ序列进行密码子偏好性和进化分析。结果植物FNSⅡ的平均有效密码子数(ENC)为52.29,表明该基因密码子偏好性较弱;ENC-Plot分析发现FNSⅡ基因密码子偏好性形成主要受突变压力的影响,但忍冬属FNSⅡ更多受到自然选择压力的影响。忍冬属FNSⅡ序列GC含量均值<50%,GC3s均值在50%左右,ENC均值为52.66,整体密码子偏好性较弱。基于FNSⅡ序列的系统进化聚类分析较相对同义密码子使用度(RSCU)聚类分析更符合传统的物种分类结果。酵母是忍冬FNSⅡ最佳外源表达系统,模式植物拟南芥、烟草均可作为忍冬FNSⅡ的遗传转化受体。结论忍冬属FNSⅡ序列表现出相似的密码子偏好性,可为忍冬属植物FNSⅡ基因的分类、演化与表达及植物育种研究提供依据。

金银花黄酮合成酶LjFNS基因克隆及序列分析

采用染色体步移的方法,首次从金银花中克隆得到LjFNS的基因组全长序列,并根据基因特异性引物克隆得到LjFNS的编码序列(coding sequence,简称CDS)。LjFNS基因全长为1 701 bp,有2个内含子和3个外显子。编码序列长1 593 bp,编码530个氨基酸。序列同源性分析表明,金银花LjFNS基因编码的CDS序列与拟南芥LOC9307309基因CDS序列相似度达89%。生物信息学分析结果显示,LjFNS基因编码蛋白中含有亚铁血红素配合基结合位点,属于细胞色素P450家族,蛋白含有跨膜结构域。LjFNS基因表达实时荧光定量PCR(q PCR)分析结果显示,LjFNS在金银花中的表达具有组织特异性与时间特异性,在白花中的表达量最高,表明该基因的表达可能与花的发育紧密相关。

忍冬属黄酮合成酶基因FNSII的SNP分析

为挖掘鉴别金银花与山银花的黄酮合成酶基因(flavone synthase II gene,FNSII)SNP位点,以基源确定的5个忍冬属(忍冬、灰毡毛忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬、华南忍冬)共计12个样本为研究对象,采用同源克隆法从各忍冬属植物中克隆FNSII基因,分析不同忍冬属植物中的SNP位点。结果显示:克隆分离到的各忍冬属FNSII基因的同源性和相似性高达95%以上;成功克隆获得红腺忍冬、黄褐毛忍冬和华南忍冬的FNSII序列;系统进化分析表明,获得的忍冬属序列与基源鉴定结果一致;通过序列比对,从12个样本中克隆得到的20条FNSII序列中鉴定到38个SNP位点,其中19个SNP位点可用于区分各种属,依据各种属间SNP的差异进行分型,获得5种基因型。

干旱胁迫对紫花苜蓿黄酮类化合物含量及其合成途径关键酶活性的影响

以3个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种为试验材料,利用不同浓度(0、5%、10%、15%、20%、25%)的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫,探究干旱胁迫对不同品种紫花苜蓿黄酮类化合物合成上游3个关键酶活性以及黄酮类化合物含量的影响。结果表明:(1)随着PEG-6000胁迫浓度的增加,3种紫花苜蓿叶片中PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸-4-羟基化酶)和4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)活性均呈先升高后降低的趋势,但不同酶类之间响应存在差异,即PAL活性在10%PEG-6000胁迫浓度下最高,C4H和4CL活性则在15%PEG-6000胁迫浓度下最高,且均显著高于相应对照。(2)3种紫花苜蓿植株地上部总黄酮含量和8种黄酮类化合物含量均随着PEG-6000胁迫浓度的增加呈先上升后下降的趋势,且均在10%~15%PEG-6000胁迫浓度时达到最高值,并显著高于相应对照。(3)各品种紫花苜蓿叶片黄酮类化合物含量与其关键酶活性呈不同程度的相关性,即紫花苜蓿黄酮类化合物合成途径上游3个关键酶活性与其地上部黄酮类化合物含量存在密切的关系。研究认为,不同程度的干旱胁迫可以通过促进黄酮类化合物合成途径上游关键酶活性的变化来调节紫花苜蓿植株中黄酮类化合物的合成,且适度干旱胁迫能显著促进相关酶活性增强和黄酮类化合物含量增加。

异黄酮及其在非豆科植物中生成的研究进展

异黄酮类物质一般是在豆科植物中生成的,但是近年来发现通过转基因技术在非豆科植物中也能合成异黄酮类物质。本文综述了近几年来大豆异黄酮的研究进展及其在非豆科植物拟南芥、烟草、玉米BMS细胞和酵母的转化研究及合成特点。

微波干燥法对洋葱中黄酮含量的影响

目的以绣线菊苷为指标,研究微波干燥法对洋葱中黄酮含量的影响。方法以微波干燥法对洋葱进行干燥,使用韩国药典方法提取绣线菊苷,高效液相色谱法检测其含量,并与传统的工业干燥法和实验室提取法对比。结果微波干燥法具有干燥时间短、干燥效率高的优点;而洋葱中类黄酮合成酶对黄酮含量有重要影响。结论微波干燥法能很好地保存洋葱中的黄酮,具有较大的开发和利用价值。

灯盏花黄酮合成酶Ⅱ基因克隆及其生物信息学分析

目的:灯盏花Erigeron breviscapus为菊科飞蓬属多年生植物,是云南省最具发展潜力的药用植物之一,灯盏乙素(scutellarin)是其主要药用成分之一。目前对灯盏乙素的生物合成途径尚缺乏了解。方法:该研究利用RT-PCR,3'-Race和5'-Race克隆得到了灯盏花黄酮合成酶Ⅱ基因(FSⅡ)的cDNA全长序列。结果:灯盏花灯FSⅡcDNA最大开放阅读框(ORF)长1 557 bp,编码518个氨基酸残基,定名为EbFSⅡ。Blastp发现,EbFSⅡ与绿毛山柳菊Hieracium pilosella,Cynara cardunculusvar.scolymus,翠菊Callistephus chinensis,非洲菊Gerbera hybrid cultivar,大丽花Dahlia pinnata和六倍利Lobelia erinus等FSⅡ的同源性最高,最大一致性为72%～84%。结论:与已报道的植物CYP93B亚家族构建进化树发现,灯盏花EbFSⅡ与直接催化黄烷酮转化为黄酮的CYP93B成员聚合在一起,因此可以推断灯盏花EbFSⅡ也具有相似的功能。

水母雪莲黄酮合成酶FNSII基因克隆及其在3种细胞系中的表达

水母雪莲是中国传统珍稀药材,其主要活性成分之一木犀草素具有预防和治疗癌症的功效。以水母雪莲绿色细胞系为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法获得1个水母雪莲FNSII基因cDNA全长,命名为SmFNSII(GenBank登录号为KF170286)。序列分析结果表明:SmFNSII全长1 710 bp,包含34 bp的5?非编码区、125 bp的3?非编码区和1个长度为1 551 bp编码516个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析表明SmFNSII属于细胞色素P450 CYP93B亚家族单氧化酶。序列比对和系统进化分析表明,SmFNSII氨基酸序列与同科植物毛山柳菊的亲缘关系最近,相似性达87%以上。实时荧光定量PCR分析表明,SmFNSII在白色、绿色和红色细胞系均有表达,红色系中的表达量最高,白色系中表达量最低,此结果与高效液相色谱分析3种颜色细胞系中木犀草素含量结果一致。构建pET-SmFNSII原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达,诱导蛋白大小与预期一致。通过筛选FNSII基因表达水平高、高产木犀草素的水母雪莲细胞系和植株,可培育抗炎抗癌活性较高、具有高保健功能的雪莲生药新品种。

粘毛黄芩SvFNSⅡ-2基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆获得粘毛黄芩中黄芩苷合成关键酶黄酮合成酶Ⅱ-2基因(FNSⅡ-2)全长,并进行生物信息学分析。方法:以粘毛黄芩总RNA为模板,采用RACE技术和序列克隆相结合的方法,获得粘毛黄芩FNSⅡ-2基因的cDNA完全编码序列并进行生物信息学分析;采用实时定量(qPCR)和高效液相色谱技术(HPLC)测定粘毛黄芩采收期不同部位FNSⅡ-2的表达量及黄芩苷的含量,并对二者进行回归及相关性分析。结果:获得SvFNSⅡ-2基因ORF区长度为1 518 bp(GenBank ID:MG737856),编码氨基酸505个,包含3个高度保守区域,分析预测编码稳定的亲水性蛋白为游离核糖体合成的胞内膜结合蛋白,二、三级结构均以α-螺旋为主体,且包含有多个磷酸化位点;qPCR和HPLC结果显示,SvFNSⅡ-2基因的表达和黄芩苷含量在根、茎、叶中均存在极显著差异(P<0.01),而且不同部位间SvFNSⅡ-2基因表达量和黄芩苷含量呈极显著正相关关系(r=0.999,P<0.01)。结论:首次克隆获得SvFNSⅡ-2基因cDNA全长,初步证明SvFNSⅡ-2是粘毛黄芩黄芩苷合成途径中重要的调控关键基因,为揭示黄芩苷分子合成机制及调控研究奠定了基础。

苦荞FtFLS1基因的功能和遗传多样性分析

前期苦荞转录组分析显示了一个介导黄酮类物质合成相关的黄酮合成酶基因FtFLS1。为进一步了解FtFLS1基因的结构、功能和基因多样性,本研究通过同源比对和保守序列分析筛选得到苦荞FLS基因家族共104个成员,其根据同源性和结构域分为10个亚族,FtFLS1属于DF8亚族。同时,启动子分析结果显示上游1500 bp启动子序列中有2个MeJA响应元件,据此,本研究分析了FtFLS1在苦荞不同器官中的表达量差异及其在MeJA不同处理时间下苦荞中的表达量差异,结果显示,FtFLS1在茎和叶中的表达相近且均要明显高于其在根中的表达,同时FtFLS1在苦荞中的表达也随着MeJA处理时间的增加而显著提高。为进一步验证FtFLS1的功能,本研究克隆了FtFLS1的CDS序列,以此构建FtFLS1的过表达苦荞毛状根株系并检测了它们的黄酮类物质含量,结果显示,相对于正常诱导的苦荞毛状根,FtFLS1的过表达毛状根明显积累了3类黄酮合成酶的下游产物:山奈酚、槲皮素和芦丁,而黄酮合成酶的底物二氢山奈酚和二氢槲皮素的含量明显降低。此外,本研究还分析了200份不同群体苦荞中FtFLS1基因的多样性,结果显示:北方群体、南方群体和喜马拉雅野生群体均拥有明显不同的FtFLS1基因型分布,其中北方群体和南方群体呈现明显的分化,研究结果为探索FtFLS1介导的黄酮类物质合成以及了解荞麦驯化过程提供了思路和参考。

干旱胁迫对不同品系藜麦内黄酮和抗氧化性的影响

利用不同浓度的PEG溶液模拟干旱胁迫,分析了干旱胁迫下不同品系藜麦叶片中黄酮类化合物合成上游的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)及4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)此3个关键酶的活性以及种子内黄酮含量和清除DPPH·能力,探究干旱胁迫对不同藜麦种子内黄酮合成以及体外抗氧化活性的影响。结果表明:(1)随着干旱胁迫增加,三种酶活性均成先增后降趋势,但不同酶之间存在差异,PAL和4CL在5%PEG胁迫下达到最大,藜麦品系NK1、NK2和NK5的C4H活性在10%PEG时达到最大,但NK3和NK4在5%PEG胁迫下达到最大;在CK和5%PEG胁迫下藜麦品系NK3的3种酶活性较高,但在10%PEG和15%PEG胁迫下酶活性迅速降低。(2)随着干旱胁迫加剧,各品系藜麦种子内黄酮含量呈先上升后下降的趋势,在CK和5%PEG胁迫下,藜麦品系NK3种子黄酮含量最高分别为2.94 mg/g和3.61 mg/g,在10%PEG和15%PEG胁迫下,NK5种子黄酮含量最高分别是2.92 mg/g和2.66 mg/g。(3)抗氧化试验表明,各品系藜麦种子内黄酮对DPPH·的清除率在5%PEG胁迫处理时达到最大,NK1、NK2、NK3、NK4和NK5清除率分别是88.52%、87.65%、90.36%、86.53%和89.38%,其中NK3 IC50(半抑制浓度)最大为9.871μg/mL。本研究结果为理解藜麦体内黄酮合成体系和抗氧化剂资源的筛选提供理论依据。