甘草黄酮合酶Ⅱ催化甘草素特异性合成7,4'-二羟基黄酮

利用同源序列比对和分子进化树分析从胀果甘草转录组数据库中挖掘并成功克隆到2个黄酮合酶基因:Gur.gene26505和Gur.gene26116。经表征Gur.gene26505为黄酮合酶Ⅱ,具有催化甘草素特异性合成7,4′-二羟基黄酮的特性,而Gur.gene26116为黄烷酮2位羟化酶,可催化甘草素生成包括7,4′-二羟基黄酮在内的三种产物。进一步通过蛋白质结构预测、分子对接和分子动力学模拟探究了黄酮合酶Ⅱ(Gur.gene26505)催化合成7,4′-二羟基黄酮特异性的原因。由于Gur.gene26505活性口袋附近特有的刚性结构β片层使大位阻苯丙氨酸残基翻转至羟化中心下方,消除了羟化产物2-羟基甘草素进入脱水中心的阻力进而发生C_(2)-C_(3)位的脱水反应特异性生成7,4′-二羟基黄酮。最后通过基因过表达、反应条件优化和强化菌体生长建立了7,4′-二羟基黄酮特异性合成的最佳细胞催化工艺,使甘草素转化率达到了76.67%。

5-氮杂胞苷影响LjFNS Ⅱ1.1和LjFNS Ⅱ2.1催化金银花木犀草素和木犀草苷合成机制的研究

该研究通过对金银花叶片进行不同时间(1,2,3 d)与不同浓度(20,40,60,80,100μmol·L-1)的5-氮杂胞苷处理,探索5-氮杂胞苷影响黄酮合酶FNSⅡ催化木犀草素和木犀草苷合成的机制。首先对Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1进行克隆;其次UPLC-MS/MS测定金银花叶中木犀草素与木犀草苷的含量,以及Real-Time PCR分析Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平,结果表明Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1基因的表达水平与木犀草素的含量变化趋势大体一致,但与木犀草苷的含量变化相关性不显著;同时发现二者之间的表达水平略有差异。研究结果表明,5-氮杂胞苷处理金银花叶片后,Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平上升,从而调控木犀草素和木犀草苷的含量升高,为研究Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1催化木犀草素和木犀草苷合成机制提供技术支撑和理论基础。

大豆浅棕茸毛色基因Td的克隆与功能分析

大豆的茸毛色由T和Td两个基因控制。在显性T位点下,Td和td分别形成棕色和浅棕色茸毛表型。影响茸毛色形成的黄酮化合物由黄酮合成酶基因FNS Ⅱ-1和FNS Ⅱ-2催化合成。本研究旨在定位并克隆Td基因。遗传连锁分析结果表明Td基因由单个基因控制,定位于3号染色体上。基因组的序列比对及测序分析结果表明,td位点在R2R3-MYB转录因子(Glyma.03G258700)编码区均存在突变,导致翻译提前终止。与野生型Harosoy-T相比,基因Glyma.03G258700,FNS Ⅱ-1和FNS Ⅱ-2在Clark-td茸毛中的表达水平极低。基因FNS Ⅱ-1和FNS Ⅱ-2启动子区均包含与MYB蛋白结合的顺式调控元件。这些结果表明,野生型Glyma.03G258700可能与FNS Ⅱ基因的启动子结合,正调控其表达,提高黄酮含量,形成棕色茸毛。相反,突变型的Glyma.03G258700不能与FNS Ⅱ基因的启动子结合,黄酮含量降低,形成浅棕茸毛。因此,推测Td位点的基因为Glyma.03G258700,编码一个R2R3型MYB转录因子。