黄鳍棘鲷SNP标记开发与验证

文章以我国东南沿海重要的经济鱼类黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)为研究对象,通过对50尾野生黄鳍棘鲷基因组重测序开发单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,并利用MassARRAY^(■)质谱分析系统对部分SNP标记进行验证。研究结果如下:1)50尾野生黄鳍棘鲷重测序共产生约233.48Gb原始数据(raw data),过滤接头和低质量数据后,共获得233.43Gb数据,每个样品平均数据量为4.67Gb,平均鸟嘌呤胞嘧啶(guanine cytosine,GC)含量为42.85%,Q20在96.56%以上,Q30在91.1%以上,过滤后数据与参考基因组的比对率为98.06%~99.47%;2)通过基因分析工具(genome analysis toolkit,GATK)分析,从50个个体中共挖掘出13843766个SNP,经过滤后获得6501个高质量SNP;3)从高质量的SNP标记中,随机挑选30个SNP使用MassARRAY技术进行分型,其检出率(可以分型的位点)为98%,MassARRAY分型结果与基因组重测序分型结果一致率为64.83%,这说明两种技术在SNP分型方面存在差异。综上所述,本研究初步建立了黄鳍棘鲷SNP标记挖掘、过滤与验证的方法,开发的SNP位点可用于后续黄鳍棘鲷增殖放流效果评估及基因组选择育种研究。

黄鳍棘鲷全长遗传力估计

黄鳍棘鲷是我国东南沿海重要的海水经济鱼类,是目前尚没有通过国家原良种审定委员会审定的新品种。为做好黄鳍棘鲷新品种选育工作,培育出生长速度快的新品种,需估计生长性状的遗传力。本研究以黄鳍棘鲷为研究对象,采用巢式设计和人工授精方法,构建了19个黄鳍棘鲷全同胞家系(包括7个半同胞家系),测量35日龄黄鳍棘鲷的生长数据,并使用MTDFREML软件对其全长进行遗传力估计。结果表明,35日龄黄鳍棘鲷全长的遗传力为(0.234±0.047),属于中等水平遗传力。研究结果可为黄鳍棘鲷的良种选育提供参考资料。

黄鳍棘鲷MSTN1基因多态性与生长性状的关联分析

一、前言黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus),在分类学上隶属于鱼纲(Pisces),鲈形目(Perciformes),鲷科(Sparidae),棘鲷属(Acanthopagrus),广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸和中国台湾、福建、广东、广西沿海。黄鳍棘鲷通常在靠近岸边的海域和河口湾生活,为杂食性鱼类,是国内一种重要经济鱼类。

黄鳍鲷精子主要生物学特性的研究

选取健康的雄性黄鳍鲷Sparus latus亲鱼进行人工采精,设定不同的盐度梯度、pH梯度,观察其对精子活力的影响,测定了精子的密度、大小和精浆的渗透压,同时用透射电镜观察精子的超微结构。结果表明,在盐度20时,精子的激烈运动时间、快速运动时间和寿命最长,分别为70、90±1.3s和861±8.6s;在pH为8.0时,激烈运动、快速运动时间和寿命也最长,分别为90±3.7s、115±9.9s和500±11.6s。测得精子的平均密度为(8.0±0.6)×109个.ml-1,精子细胞核的长径为2.75±0.93μm,短径为2.25±0.68μm,鞭毛长为41.52±6.76μm,精浆的平均渗透压为342.6±12.35mmol.kg-1。超微结构显示,精子头部呈圆形或卵圆形,头部无顶体结构,植入窝位于细胞核底端的中间,中心粒复合体位于植入窝内,其中近端中心粒位于植入窝的上段,基体位于植入窝的下段。袖套位于核后端,两侧分布有线粒体和囊泡。尾部细长,其主要结构是轴丝,轴丝为典型的"9+2"微管结构。

黄鳍鲷幼鱼对几种不同糖源的利用(英文)

本研究用来评价黄鳍鲷幼鱼对饲料中葡萄糖、麦芽糖、糊精、玉米淀粉和预糊化玉米淀粉的利用。本试验饲料为6种等氮(粗蛋白:45%,干重)等脂(粗脂肪:9%,干重)的半纯化饲料,其中对照组糖源为纤维素。每种饲料设3个平行。试验鱼初始体重为(3.57±0.13)g(平均值±均差)。试验鱼饲养在含18个水族箱的循环系统中。水温保持在(27±1)℃。试验周期为8周。本试验用来评价黄鳍鲷幼鱼对饲料中不同糖源利用的指标为生长指标、饲料效率、蛋白质效率和肝脏的6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。试验结果表明,黄鳍鲷幼鱼体增重、特定生长率、肝体比、肠系膜脂肪体比、饲料效率、蛋白质效率、肝脂肪合成有关酶活性和全鱼、肌肉、肝脏组成均受到饲料中不同糖源的显著影响。预糊化玉米淀粉和麦芽糖组比其它糖源组显著具有更好的体增重和特定生长率,但与对照组没有显著性差异。黄鳍鲷幼鱼生长和体增重与饲料中糖源的复杂性没有相关性。饲喂预糊化淀粉和对照饲料鱼的饲料效率和蛋白质效率显著比其它组高。饲料中糖的添加增加了黄鳍鲷幼鱼的肝体比,但对照组肝体比与糊精组,玉米淀粉组没有显著性差异。预糊化玉米淀粉组肠系膜脂肪体比比其它饲料组要高。结论:基于体增重和特定生长率为指标,饲料中添加25%预糊化玉米淀粉和麦芽糖可以提高黄鳍鲷幼鱼的生长。另外,玉米淀粉预糊化显著提高了黄鳍鲷对玉米淀粉的利用。

厦门湾黄鳍鲷增殖放流效果的评估

采用黄鳍鲷挂牌标志放流和流刺网探捕相结合的方法,开展对厦门湾黄鳍鲷增殖放流效果的评估.于2011年在厦门五缘湾增殖放流97万尾黄鳍鲷苗种,其中放流标志黄鳍鲷苗种15 036尾.结果表明,一年标志鱼回捕率为0.612%;放流标志鱼主要回捕海域为厦门湾大离浦屿—后田—刘五店—欧厝—小嶝岛邻近海域;放流黄鳍鲷在海区的生长情况良好,平均生长速度约0.56 g/d;经1 a时间,放流黄鳍鲷平均尾重约0.27 kg,形成资源量约263 t,形成捕捞产量约1.61 t;从2006到2011年每年进行增殖放流,结果使厦门湾黄鳍鲷种群的相对资源量比例提高了约3.83%.表明,黄鳍鲷增殖放流获得了一定的资源增殖效果.

半胱胺盐酸盐和LHRH-A对黄鳍鲷IGF-Ⅰ基因表达和生长的影响

本文以黄鳍鲷 (Sparuslatus)为研究对象 ,利用GeneRaceTM 技术 ,从其肝组织中克隆出类胰岛素生长因子 (IGF Ⅰ )cDNA ,并应用半定量RT PCR方法研究了半胱胺盐酸盐 (Cysteaminehydrochloride)和LHRH A对其肝组织IGF Ⅰ基因表达的影响。黄鳍鲷IGF ⅠcDNA全长为 84 0bp ,编码 185aa多肽 ;序列分析表明 ,黄鳍鲷IGF Ⅰ基因编码的氨基酸序列与金鱼的同源性为 75 8% ,与牙鲆的同源性为 86 5 % ,与同属鲷科的黑鲷同源性高达 10 0 % ,证明鱼类类胰岛素生长因子是非常保守的 ,E区域分析结果表明黄鳍鲷IGF Ⅰ属Ea 4型。在饲料中投喂CSH、LHRH A等添加剂 ,实验组黄鳍鲷鱼种的相对生长率、垂体GH含量、肝脏IGF ⅠmRNA水平均显著高于对照组。以上结果提示 :CSH、LHRH A能促进黄鳍鲷生长激素的合成和IGF Ⅰ基因的表达 。

3个水域黄鳍鲷线粒体DNA D-loop基因序列多态性研究

利用PCR技术扩增海南海口市、福建厦门市和广东珠海市3个地理群体海捕黄鳍鲷线粒体D-loop基因片段,测定了该基因片段580bp序列。结果发现,3个地理群体内和群体间都存在丰富的DNA序列多态性,共检测到33个多态性核苷酸位点(5.7％),24个个体具有22种单倍型(haplotype)。UPGMA法构建的分子系统树中,海南群体内所有的单倍型聚成一支,福建与广东的单倍型混杂在一起,聚成一支。从序列差异的分析中得出,海南群体与福建和广东群体的亲缘关系较远;福建群体和广东群体亲缘关系较近。

野生与养殖黄鳍鲷消化道中粘液细胞的类型及分布

采用常规石蜡组织切片及AB-PAS的染色方法对野生和养殖黄鳍鲷(Sparus latus)消化道中粘液细胞的类型及分布情况进行了比较观察研究。黄鳍鲷粘液细胞在消化道各部位均有分布,不同部位粘液细胞的类型和分布均有差异。食道中以Ⅰ、Ⅱ型粘液细胞为主;贲门部和胃体部只有Ⅰ、Ⅱ型粘液细胞分布,幽门部只有Ⅰ型粘液细胞;幽门盲囊、肠道及直肠都是Ⅱ型粘液细胞最多。野生与养殖黄鳍鲷粘液细胞的区别在于消化道的相同部位养殖鱼比野生鱼粘液细胞数量更多。根据研究结果推测粘液细胞的类型和分布与鱼的生活环境及食物相关,也可能与消化道中各种菌群的分布有关。

黄鳍鲷(Sparus latus)两种生长激素受体的cDNA克隆及组织表达分析

采用RT-PCR方法克隆了黄鳍鲷两种生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)的cDNA序列,序列分析表明:GHR1开放阅读框为1935bp,共编码645个氨基酸,GHR2开放阅读框为1749bp,共编码583个氨基酸,GHR1与GHR2的氨基酸同源性为36.7%。GHR1和GHR2在分子结构上存在显著差异,GHR1胞外域有7个半胱氨酸残基而GHR2只有6个;GHR1胞内域有9个酪氨酸残基而GHR2只有5个,两者的结构差异表明两者可能具有不同的生物学功能。用Real-timeRT-PCR方法研究了GHR1和GHR2在各组织的分布情况,结果表明:GHR1和GHR2在所检测的10种组织中均有表达,其中以肝脏、肌肉、垂体表达量较高,且在大部分组织中GHR2表达量均高于GHR1。

盐度对黄鳍鲷幼鱼消化酶活性的影响及消化酶活性的昼夜变化

研究了盐度对黄鳍鲷幼鱼主要消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的影响及消化酶活性的昼夜变化。实验设计5、10、15、20、25、30等6个盐度梯度组。结果表明，蛋白酶、脂肪酶的比活在盐度为25时最高，而淀粉酶的比活在盐度为20时最高。各种消化酶在盐度20～30时消化酶比活的平均值要明显高于5～15时消化酶的平均值。对黄鳍鲷消化酶比活昼夜变化的测定表明，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶比活的最高值分别在14：00、20：00和18：00，最低值分别是12：00、10：00和6：00。

温度对黄鳍鲷主要消化酶活性的影响

研究了温度对黄鳍鲷肝、肠和胃3个部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶比活的影响。实验设计了15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃等11个温度梯度，结果表明：肠蛋白酶和胃蛋白酶的最适温度为45℃，而肝蛋白酶的最适温度为40~C；胃淀粉酶的最适温度是40℃，肝淀粉酶的最适温度是35℃，而肠淀粉酶的最适温度是30℃；肠脂肪酶和胃脂肪酶的最适温度是40℃，肝脂肪酶的最适温度是45℃。从整体来看，在35-45℃的范围内，肝、肠和胃3部位的3种酶鸭有较高的活性。

穿体标志对黄鳍鲷幼鱼的生长、存活及脱标的影响

研究了不同幼鱼规格、标志部位和消毒处理对黄鳍鲷存活的影响,探讨了不同标志部位幼鱼的脱标情况。结果显示,不同规格、标志部位和消毒处理对黄鳍鲷幼鱼的存活无显著差异;但标志后进行1次消毒处理可使黄鳍鲷的存活稳定期提早一天出现。标志部位对黄鳍鲷幼鱼的存活有显著影响,以背鳍棘基部肌肉标志的存活率为最高,达87.0%;背鳍棘膜标志的存活率其次,为75.2%;而背鳍条基部肌肉标志的存活率最低,仅68.0%;死亡高峰均出现在标志后前3 d。幼鱼规格对脱标无影响,但标志部位对脱标影响显著。在肌肉做标志均未脱标,而在鳍棘膜做标志的全部脱标。表明黄鳍鲷幼鱼可在背鳍棘基部肌肉进行穿体标志,暂养4 d后进行放流。

黄鳍鲷消化道内分泌细胞的免疫组化定位

应用4种兔抗胃肠激素抗体和SABC免疫组织化学方法,对黄鳍鲷(Sparuslatus)消化道中的内分泌细胞进行鉴别和定位。结果表明:PP细胞在幽门盲囊较为丰富,食道和小肠较少。Som细胞在贲门胃分布密度最高,在食道和幽门胃也有较多分布。5-HT细胞主要分布在食道和胃部,在幽门盲囊和小肠数量较少。NPY细胞在消化道各部位均未发现。黄鳍鲷消化道PP、Som和5-HT细胞的数量分布和形态特征存在一定的差异,为参与不同的消化生理作用提供了形态学依据。

黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)血清IgM,并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS-PAGE,电泳结果扫描后经Band Scan5.0软件分析显示,单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56%左右;二者联合使用纯度可以达到69%,而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89%的纯度;纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73.6kD和26.5kD。本研究还以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,采用WesternBlot和双向琼脂扩散检测抗血清免疫学活性,并用间接ELISA检测其效价达到1∶25600,为进一步开展黄鳍棘鲷免疫学方面的研究奠定了基础。

半胱胺盐酸盐和LHRH-A对黄鳍鲷生长激素分泌的影响

研究了生长抑素抑制剂半胱胺盐酸盐(CSH)和促黄体素释放激素类似物(LHRH A)对黄鳍鲷生长激素(GH)分泌的影响.黄鳍鲷垂体GH含量在单独注射不同剂量CSH(25,50,100μg/gb.w)后2h均显著提高,注射后24h恢复正常.黄鳍鲷血清中GH水平在注射CSH(100μg/gb.w)后2h和CSH(25,50μg/gb.w)后6h均明显提高.单独注射LHRH A(0.1μg/gb.w)后2h黄鳍鲷垂体GH含量和血清中GH水平均明显提高.注射CSH和LHRH A后6h垂体GH含量明显高于单独注射CSH或LHRH A,而血清GH水平在注射后12h明显高于单独注射CSH或LHRH A.结果表明CSH和LHRH A都能明显刺激黄鳍鲷垂体合成和释放GH,并且与CSH作用存在剂量依存关系,CSH和LHRH A联合注射比单独注射作用更明显,作用的时间更持久.

黄鳍鲷2个自然群体遗传变异的RAPD分析

用RAPD技术对福建和珠江口2个自然黄鳍鲷(Sparuslatus)群体进行群体内与群体间的遗传变异分析。在使用的40个随机引物中,有18个引物扩增出清晰稳定的片段,共计93条,大小为200—2500bp,其中多态性片段41条,多态性片段的比例为44.09%。福建和珠江口群体内的相似系数分别为0.8821和0.8785,群体内遗传距离分别为0.1179和0.1215,2个群体间的遗传距离为0.1314。福建和珠江口2个群体内都有较高程度的遗传变异水平,但福建群体的遗传变异水平较珠江口群体的低。用类平均聚类法和邻接法进行聚类分析,结果表明,福建和珠江口群体分别聚成一支,且两者的聚类结果一致。说明福建和珠江口群体已经开始出现了遗传分化,分别属于2个不同的地理群体。

黄鳍鲷和尼罗罗非鱼鳃丝表面结构扫描电镜观察

黄鳍鲷Sarus latus和尼罗罗非鱼Oreochromis nilotica鳃丝和鳃小片表面都具有规则或不规则分布的环形微嵴、沟状或坑状凹陷及孔洞等结构。黄鳍鲷的鳃丝表面一部分鳃丝表皮凹凸不平,另一部分鳃丝表皮较为平坦。黄鳍鲷和尼罗罗非鱼鳃上皮几种细胞的形态结构及数量分布存在细微的差异。黄鳍鲷的扁平上皮细胞表面观以不规则的六边形为主,或类似菱形的四边形,细胞间界限清楚,而尼罗罗非鱼鳃丝细胞表面的微嵴以形成密集指纹状回路,隆起的微嵴两侧有细小的横突,扁平上皮细胞间排列凹凸不平,形成深沟或凹坑,成为细胞间明确的界线。黄鳍鲷鳃丝表面的氯细胞和粘液细胞数量较多,尼罗罗非鱼鳃丝表面基本上没有观察到氯细胞,粘液细胞很少。黄鳍鲷鳃小片的厚度比尼罗罗非鱼鳃小片的厚。

黄鳍鲷仔、稚、幼鱼消化道形态组织学观察

【目的】了解黄鳍鲷(Sparus latus)仔、稚、幼鱼消化道的形态组织学特征,为其发育生物学研究和鱼苗健康繁育提供理论依据,进一步充实黄鳍鲷生物学研究文库。【方法】采用常规石蜡组织切片的方法,对黄鳍鲷仔、稚、幼鱼消化道的形态组织进行观察。【结果】2日龄仔鱼消化道仅为一条未分化的管道;5日龄仔鱼消化道分化为食道、胃和肠道,食道黏膜上皮由立方状细胞组成,胃黏膜上皮由单层矮柱状细胞组成,二者均无黏膜褶皱,肠分化为小肠和直肠,小肠壁内部出现黏膜褶皱,直肠内壁无褶皱;7日龄仔鱼消化道进一步分化,各段管壁增厚,食道和胃内壁仍无黏膜褶皱,幽门盲囊开始分化,小肠黏膜上皮中含有大量杯状细胞。稚鱼消化道在质方面向幼鱼的基本型发育,食道、胃、幽门盲囊、肠道表现出固有的类型和数量,消化道扩张,肌肉层加厚,黏膜褶皱加深,杯状细胞增多。幼鱼消化道进一步发育完善,其组织结构与成鱼相似,由食道、胃、幽门盲囊、小肠和直肠组成;各部分管壁从内到外都分化为黏膜层、黏膜下层、肌肉层和浆膜层。【结论】黄鳍鲷消化道的胚后发育特征与其摄食方式及功能相适应,进一步证实无论鱼类处于生长发育的任何阶段,其消化道形态组织结构均与功能密切相关。

地衣芽孢杆菌De株对黄鳍鲷生长及其养殖池塘主要环境因子的影响

运用综合对比分析法,对黄鳍鲷(Sparu slatus)养殖中定期泼洒地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)De的应用效果进行了探讨。结果表明,施用地衣芽孢杆菌De可在一定程度上优化水体环境和养殖生产性能,使养殖黄鳍鲷的成活率、体长增长率和体质量增长率分别提高18.2%、21.0%和312%;显著降低水中氨氮(NH3-N)、亚硝酸盐(NO2-N)、活性磷酸盐(PO43-P)质量浓度及底泥中有机碳的质量分数(P<0.05),其中养殖前、后期的底泥有机碳质量分数分别较对照组降低49.77%和22.63%,NO2-N、PO34-P质量浓度则总体较对照组降低25.82%和41.00%,NH3-N质量浓度在养殖前、中和后期较对照组降低36.33%、18.10%和14.28%;水体中弧菌数量在养殖后期较对照组降低61.76%,底泥中的总异养细菌数量在养殖中、后期较对照组提高38.61%,整个养殖期间水体及底泥中的芽孢杆菌数量分别较对照组提高15.34%和26.37%。