Mg^2+介导底物亲和力的改变增加黍子过氧化物酶的磷酸酶活性

黍子过氧化物酶(proso millet peroxidase,PmPOD)具有磷酸酶活性,可以断裂DNA中磷酸二酯键及脱氧核糖核苷酸(dNMPs)中磷酸单酯键。在此反应过程中,Mg^2+显著增强PmPOD的磷酸酶活性,但其具体的机制尚不明确。本文采用紫外-可见分光光谱法和荧光光谱法,研究了以dNMPs为底物时,Mg^2+对PmPOD磷酸酶活性的影响,并对其反应机制进行了初步的探究。紫外-可见分光光度法结果表明:Mg^2+介导了PmPOD与底物的相互作用,但Mg^2+并未直接与PmPOD发生相互作用。荧光光谱进一步表明,在Mg^2+存在的情况下,dNMPs对PmPOD内源荧光淬灭方式发生变化,由动态淬灭转变为静态淬灭。同时还发现,dNMPs与PmPOD的结合常数Ka增加约2~10倍(与不存在Mg^2+条件相比),依次为:KadCMP>KadGMP>KadTMP>KadAMP。高效液相色谱表明,Mg^2+可增强PmPOD水解dNMPs的速率3~13倍,且水解速率VdCMP>VdGMP>VdTMP>VdAMP,与结合常数的变化一致。因此,我们得出结论,PmPOD发挥磷酸酶活性时,Mg^2+首先与dNMPs形成中间产物,这一中间产物更适合与PmPOD形成复合物,增大了底物dNMPs与PmPOD结合常数,进而加速了PmPOD水解dNMPs。本研究为Mg^2+在过氧化物酶催化DNA水解的机制提供了相关依据,为研究金属离子增强蛋白酶活性的机制提供了理论基础。