淫羊藿素通过调控黏着斑激酶及下游细胞外信号调节激酶/细胞周期蛋白D1和蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路抑制肝癌细胞增殖的作用机制研究

目的探究淫羊藿素(icaritin,ICA)抑制肝癌细胞增殖的作用机制。方法以Huh7肝癌细胞为研究对象并在体外培养;设置200、100、50、20、10、5、2、1、0.5μmol/L不同浓度的ICA给药干预72小时之后,采用0.5%结晶紫染色分析ICA对Huh7肝癌细胞生存的影响;将Huh7肝癌细胞给与ICA高(10μmol/L)、中(5μmol/L)、低(2.5μmol/L)三个浓度,每个浓度设置三个复孔,通过克隆形成实验检测ICA对Huh7肝癌细胞增殖能力的影响;Huh7肝癌细胞给与ICA IC 50值浓度,对照孔及ICA给药孔分别在0、6、12、24小时在倒置显微镜下拍照,通过细胞划痕分析ICA对肝癌细胞迁移能力的影响;并且用流式细胞术对细胞周期进行分析。另外,通过蛋白印迹对增殖相关蛋白,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,p-FAK)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)等蛋白的表达水平进行分析。结果ICA可以明显抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力,并且使肝癌细胞的细胞周期在G1期发生阻滞(P<0.05)。另外,研究发现ICA可以下调p-FAK及其下游调节蛋白p-ERK、cyclin D1以及p-Akt、p-mTOR、p-S6的表达水平。结论ICA可能通过调控FAK及下游ERK/cyclin D1和Akt/mTOR信号通路从而抑制肝癌细胞的增殖生长。

中药通过细胞外信号调节激酶信号通路调控胃癌的研究进展

胃癌在我国发病率和死亡率较高,存在发现晚、5年生存率低的特点,手术切除仍然是临床治疗的主要方法。大鼠肉瘤蛋白(Ras)/迅速加速性纤维肉瘤蛋白(Raf)/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在调控细胞增殖、转移、凋亡等方面具有非常重要的作用,与胃癌的发生与发展密切相关。近年来,很多学者探索调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路治疗胃癌的作用机制,在信号转导机制研究、靶向抑制剂筛选、中医药治疗等方面取得大量成果,实验验证在胃癌的治疗中干预其信号传递具有良好的效果和应用前景。

乙肝肝纤维化患者肝组织黏着斑激酶、蛋白激酶B的表达及意义

目的:探讨乙肝肝纤维化患者肝组织黏着斑激酶(FAK)、蛋白激酶B(AKT)的表达及其意义。方法:纳入75例行肝脏穿刺的慢性乙肝患者作为研究对象,根据纤维化程度(HE和Masson染色)将其分为A组(S0-S1级,n=26)、B组(S2级,n=27)、C组(S3-S4级,n=22)。收集并比较各组患者性别、年龄、总胆红素(TBIL)、肝脏弹性硬度(LSM)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等一般资料。应用S-P免疫组织化学、Western blot、实时荧光定量PCR检测并比较各组FAK、AKT蛋白及基因水平。结果:各组患者性别、TBIL差异均无统计学意义(P>0.05);各组年龄、LSM、ALT、AST比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示,各组患者肝组织中FAK、AKT蛋白阳性表达积分比较:A组<B组<C组(P<0.05),各组p-AKT蛋白表达积分比较:A组>B组>C组(P<0.05)。Western blot结果显示,各组肝组织中FAK、AKT蛋白相对表达水平比较:A组<B组<C组(P<0.05),各组p-FAK、p-AKT蛋白相对表达水平比较:A组>B组>C组(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,各组肝组织中FAK、AKT基因mRNA相对表达水平比较:A组<B组<C组(P<0.05)。结论:FAK、AKT表达水平与乙肝患者肝纤维化的发生及肝纤维化程度密切相关。

黏着斑激酶和细胞外信号调节激酶在SACC-LM和SACC-83细胞中的表达及其意义

目的:检测黏着斑激酶(FAK)及细胞外信号调节激酶(ERK)在涎腺腺样囊性癌(SACC)细胞系SACC-LM和SACC-83中的表达,探讨其与SACC肺转移发生的关系。方法:选择停止在G1/S期的SACC-LM和SACC-83细胞,测定其细胞内FAK和ERK酶活力,采用Western blotting方法检测SACC-LM及SACC-83细胞中FAK及ERK蛋白表达,对其结果进行量化分析。结果:FAK及ERK在SACC-LM细胞中的活性均高于SACC-83细胞(P<0.01),SACC-LM细胞中FAK酶活性与ERK酶活性呈正相关关系(r=0.62,P<0.05)。Western blotting方法检测到在SACC-LM细胞中两种蛋白的表达水平均高于在SACC-83细胞中的表达水平(P<0.05)。结论:FAK及ERK可能参与了SACC的发生发展过程和转移信号转导通路,FAK及ERK蛋白表达变化与SACC的转移行为有关。

人黏着斑激酶(FAK)原核表达及多克隆抗体制备与鉴定

目的克隆、表达与纯化黏着斑激酶(FAK)基因C端黏着斑定位序列(第798~1041位氨基酸),制备兔抗FAK多克隆抗体并鉴定。方法PCR法体外扩增FAK基因C端序列(2671~3402 bp),克隆至pCZN1,构建pCZN1-FAK重组表达载体,将重组表达载体转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达;利用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金属鳌合亲和层析树脂进行蛋白纯化,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot法进行效价和特异性鉴定。结果成功构建pCZN1-FAK重组表达载体,FAK蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白纯化后,制备的兔抗FAK多克隆抗体效价达1∶512000,且与外源和内源FAK蛋白发生特异性反应。结论成功克隆、表达与纯化FAK蛋白,制备兔抗FAK多克隆抗体,可用于内源FAK蛋白特异性检测。

乌司他丁对脑出血大鼠局部黏着斑激酶/细胞外信号调节激酶信号通路及神经元凋亡的影响

目的探讨乌司他丁(UTI)对脑出血(ICH)大鼠局部黏着斑激酶(FAK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路及神经元凋亡的影响。方法建立ICH大鼠模型,使用随机数字表法将造模成功的大鼠随机分为模型组(尾静脉注射0.9%氯化钠溶液)、抑制剂组(FAK抑制剂PF562271,50 mg/kg灌胃)、UTI组(尾静脉注射10万U/kg UTI)、UTI+抑制剂组(FAK抑制剂PF562271,50 mg/kg灌胃同时尾静脉注射10万U/kg UTI),每组20只,另设20只为假手术组(尾静脉注射0.9%氯化钠溶液)作为对照,所有处理均每天1次,连续7 d。干湿比重法测定各组大鼠脑组织含水率;酶联免疫吸附(ELISA)法各组大鼠血清中炎性因子含量;原位末端标记(TUNEL)法检测各组大鼠海马组织神经元凋亡;免疫组织化学分析法检测大鼠海马组织抗凋亡因子B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和促凋亡因子Bcl相关X(Bax)、胱天蛋白酶3(caspase-3)表达;尼氏染色法检测各组大鼠海马组织中神经元存活情况;蛋白质印迹法(Western blotting)法检测大鼠海马组织中FAK蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠脑组织含水率(84.51±7.42)%、炎性因子含量、神经元凋亡指数(44.51±3.77)%以及促凋亡因子Bax(3.05±0.41)、caspase-3(3.27±0.46)表达和ERK1/2磷酸化水平升高,神经元存活数目、抑凋亡因子Bcl-2(1.23±0.21)表达以及FAK(0.29±0.07)蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组相比,UTI组大鼠脑组织含水率(71.43±6.11)%、炎性因子含量、神经元凋亡指数(15.34±0.76)%以及促凋亡因子Bax(2.03±0.15)、caspcase-3(2.27±0.61)表达和ERK1/2磷酸化水平降低,神经元存活数目、抑凋亡因子Bcl-2(2.67±0.27)表达以及FAK(0.58±0.09)蛋白表达升高(P<0.05);抑制剂组大鼠脑组织含水率(92.83±7.56)%、炎性因子含量、神经元凋亡指数(51.99±5.65)%以及促凋亡因子Bax(3.73±0.37)、caspcase-3(3.99±0.26)表达和ERK1/2磷酸化水平升高,神经元存活数目、抑凋亡因子Bcl-2(0.73±0.06)表达以及FAK(0.12±0.02)蛋白表达水平降低(P<0.05)。与UTI组相比,UTI+抑制剂组大鼠脑组织含水率(84.16±6.76)%、炎性因子含量、神经元凋亡指数(43.22±4.07)%以及促凋亡因子Bax(2.98±0.35)、caspcase-3(3.26±0.31)表达和ERK1/2磷酸化水平升高,神经元存活数目、抑凋亡因子Bcl-2(1.27±0.12)表达以及FAK(0.28±0.03)蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论UTI可通过促进FAK蛋白表达,抑制ERK磷酸化,进而抑制ICH大鼠神经元凋亡。

细胞外信号调节激酶1/2信号通路调控细胞侵袭性的研究进展

细胞外信号调节激酶(ERK)1/2是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,参与Ras-Raf有丝分裂原激活蛋白激酶-ERK的信号转导级联,通过影响基因的转录和表达,参与细胞的生长、增殖甚至侵袭作用。肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症及子痫前期等多种疾病的发生,以及其疾病的转移和病情的进展,均与ERK1/2信号通路调控细胞侵袭性密切相关。因此通过探索ERK1/2信号通路侵袭性在相关疾病发病过程中可能发挥的重要作用,从而寻找更加有效的治疗方案。本文根据近些年国内外的最新研究,介绍ERK1/2信号通路侵袭性这一特性在各个疾病中所发挥的相关调控作用,以期为相关疾病的临床治疗研究提供新启示。

中药清肾颗粒对肾纤维化大鼠黏着斑激酶-Ras-丝裂素活化蛋白激酶信号转导通路的干预作用

目的：观察中药清肾颗粒对肾间质纤维化（RIF）大鼠肾组织黏着斑激酶-Ras-丝裂素活化蛋白激酶（FAK-Ras-MAPK）信号转导通路的影响。方法将40只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、百令胶囊组和清肾颗粒组，每组10只。采用单侧输尿管结扎（UUO）法制备RIF大鼠模型。术后百令胶囊组将百令胶囊溶于4 mL温水按0.3 g·kg-1·d-1灌胃；清肾颗粒组将清肾颗粒溶于4 mL温水按6 g·kg-1·d-1灌胃，正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。8周后检测各组大鼠血尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、纤维连接蛋白（FN）、α-肌动蛋白（α-SMA）水平；采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织FAK、Ras、p38MAPK、FN、α-SMA的表达水平。结果模型组大鼠血清BUN、SCr、FN、α-SMA水平高于正常对照组；清肾颗粒组和百令胶囊组给药前血清BUN、SCr水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；给药后两组BUN、SCr、FN、α-SMA均较模型组显著降低，且以清肾颗粒组降低更显著〔BUN（mmol/L）：13.18±4.91比18.56±5.59，SCr （μmol/L）：104.80±12.04比119.02±12.47，FN（mg/L）：29.72±16.75比46.38±8.63，α-SMA（kU/L）：5.49±2.68比7.13±2.37，均P＜0.05〕；免疫组化结果显示：模型组大鼠肾脏组织中FAK、Ras、p38MAPK及FN、α-SMA表达均高于正常对照组，清肾颗粒组和百令胶囊组上述各指标表达均较模型组显著降低，且以清肾颗粒组的下降程度更显著（FAK：3.00±1.41比5.28±2.21，FN：4.25±1.04比6.29±2.06，α-SMA：3.25±1.28比4.86±1.57， p38MAPK：2.50±1.31比4.71±2.50，Ras：3.50±1.41比4.29±1.38，均P＜0.05）。结论清肾颗粒可以降低RIF大鼠血清BUN、SCr水平，抑制肾脏内FAK-Ras-MAPK信号转导通路的活化，从而减少FN和α-SMA生成，发挥抗RIF作用。

整合素α5β1介导的粘着斑激酶和细胞外信号调节激酶信号传导通路对K562细胞增殖的影响

【目的】分析整合素α5β1介导的粘着斑激酶(FAK)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路对K562细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。【方法】应用四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)检测抗整合素α5β1单抗(Anti-α5β1)对K562细胞增殖的抑制作用,应用反转录PCR(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)方法检测FAK和ERK的mRNA和蛋白表达水平的改变。【结果】Anti-α5β1明显抑制K562细胞的增殖,下调细胞内总FAK及ERK的mRNA和蛋白表达,并抑制其磷酸化水平。【结论】整合素α5β1介导的FAK-ras-ERK信号转导通路可能参与了K562细胞的增殖调控,阻断此通路可明显抑制K562细胞的增殖。

黏着斑激酶在整合素信号转导中的研究进展

黏着斑激酶（focal adhesion kinase ，FAK ），是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶（NRPTK），它可通过整合细胞外信号和介导细胞内的一系列生化反应来调节下游分子的活性，参与生长发育、细胞增殖、迁移、存活、凋亡等过程。近年来的研究表明，由整合素（integrin）激活 FAK 介导的信号转导及各信号通路间的相互“对话”在肿瘤的发生、发展中起着关键性作用。但是，越来越多的学者开始关注整合素-FAK信号通路中积极行使破骨细胞功能方面的研究，这将为正畸学领域加速牙移动提供实验依据。因此，本文就FA K信号转导以及在口腔领域的最新研究进展进行综述。

RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路在胃癌中的研究进展

胃癌(GC)的发病机制复杂,与多种因素有关,包括环境和遗传因素等。细胞内信号通路失调代表了一种常见的致病机制,可能适合对患者进行靶向药物治疗。RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在多种恶性肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用。但迄今为止,大多数针对此通路的药物研究是基础实验,临床试验有待开展。本文就RAS/RAF/MEK/ERK信号通路在GC中的研究进展进行综述,重点论述其与GC的关系及潜在的作用机制,以及RAS/RAF/MEK/ERK信号通路抑制剂在GC治疗中的应用前景,旨在为GC的早期诊断和治疗提供新思路。

黏着斑激酶信号通路在细菌侵入非吞噬细胞中的作用

细菌对宿主细胞的黏附和侵袭是引发传染病的重要步骤。细菌在黏附的过程中,其表面结构或特殊黏附分子和宿主细胞表面受体相互作用激活黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),通过FAK/Src-Cortactin-Arp2/3通路和FAK/PI3K-Rac通路调控细胞骨架重排,促进细菌侵入非吞噬细胞。为了深入探讨细菌侵入非吞噬细胞的整个过程及调控机制,就细菌对非吞噬细胞的黏附、侵入以及细胞FAK信号通路在此过程中的调节作用进行综述。

抑制黏着斑激酶经Akt/NF-κB信号通路逆转结肠癌多细胞耐药

目的探讨抑制黏着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)在结肠癌HT29细胞中的表达能否逆转结肠癌多细胞耐药。方法采用免疫细胞化学和Westernblot检测单层细胞中FAK、FAKp的抑制情况,用MTT法检测单层细胞和多细胞球对5-FU敏感性的变化,采用流式细胞术检测抑制FAK对多细胞球5-FU诱导凋亡和自然凋亡的影响,免疫细胞化学检测单层细胞、Westernblot检测多细胞球中FAKshRNA干扰对Akt、NF-κB、Bcl-2、Caspase-3的影响。结果靶向干扰FAK能显著抑制单层细胞FAK、FAKp蛋白表达。MTT结果显示,FAKshRNA干扰增强了单层细胞和多细胞球对5-FU的敏感性,特别是后者,且二者差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术结果显示,FAKshRNA干扰能够使多细胞球的自发凋亡率和5-FU诱导凋亡率显著增加(P=0.001,P=0.000),且两者之间差异显著(P=0.003)。在单层和多细胞球细胞中,FAKshRNA干扰后,Akt、NF-κB、Bcl-2的水平明显下调,而Caspase-3水平上调。结论抑制FAK表达能增强结肠癌多细胞球细胞对5-FU的敏感性,逆转其多细胞耐药性,其分子机制是通过FAK/Akt/NF-κB信号通路实现的。

创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

背景:创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂,黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。目的:探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。方法:取20只SD大鼠制备股骨骨折模型。造模后5d,根据血栓形成情况将模型大鼠分为2组:血栓形成组和无血栓形成组,每组10只。另取10只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织,抽取总RNA,Genechip Rat Genome4302.0芯片测定股静脉RNA的表达,并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。结果与结论:与无血栓形成组比较,血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因均上调;下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血栓生物学状态的重要信号通路。

微电场通过活化黏着斑激酶信号通路促进缺氧条件下绒毛外滋养细胞的迁移/侵袭

目的探讨微电场刺激及缺氧条件对黏着斑激酶(FAK)信号通路的作用及对人胎盘绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo迁移/侵袭的影响。方法划痕实验分析绒毛外滋养细胞在缺氧条件下的迁移情况;western blot检测微电场刺激后绒毛外滋养细胞FAK Tyr397和p Y576/577位点及其下游柱蛋白(paxillin)分子磷酸化水平,并检测微电场刺激5、10 h后HTR-8/SVneo细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达水平;2、5、10μmol/L FAK抑制剂PF-573228处理HTR-8/SVneo细胞后观察细胞行为,并用western blot检测其MMP-2的表达水平。结果微电场刺激能改善缺氧条件下HTR-8/SVneo细胞的迁移速度;与对照组比较,缺氧条件下微电场刺激可促使FAK Tyr397位点磷酸化水平及paxillin分子表达水平明显升高(P均<0.05),而p Y576/577位点则无明显改变;经微电场刺激5、10 h后,HTR-8/SVneo细胞MMP-2表达水平均升高(P均<0.05);经FAK抑制剂处理后,HTR-8/SVneo细胞对微电场的应答反应明显受抑制,其MMP-2表达水平降低。结论微电场可能通过活化FAK信号通路促进缺氧培养绒毛外滋养细胞的迁移/侵袭。

骨桥蛋白诱导的黏着斑激酶信号途径参与大肠癌的侵袭与转移

目的观察并分析大肠癌中骨桥蛋白(OPN)、整合素β3、黏着斑激酶(FAK)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的表达特点、相互关系以及与大肠癌进展的相关性,试图揭示介导大肠癌侵袭的信号途径。方法采用SABC免疫组织化学方法,检测这4种抗原在14例结肠癌组织和16例直肠癌组织以及相应的正常组织中的表达。结果OPN在正常组织中主要表达于间质,而在大肠癌组织中主要分布于实质,且随Dukes分期的进展,实质中OPN的阳性染色颗粒逐渐增多,间质中却明显减少;整合素β3在正常组织中呈中等量表达,而在肿瘤组织中几乎检测不到其存在;FAK和PI3K在正常组织中基本无表达,而在肿瘤组织中其表达量明显升高,其表达水平与肿瘤Dukes分期密切相关,二者在肿瘤实质中的表达模式与OPN具有明显的一致性。结论OPN诱导的FAK和PI3K信号途径参与了大肠癌中晚期发生的侵袭与转移过程。

黏着斑激酶信号转导及生物学效应

黏着斑激酶(FAK)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶,起介导细胞外信号由整合素向细胞内转导的作用,FAK的磷酸化激活以及由此所产生的一系列下游蛋白质的磷酸化,是细胞外基质与细胞相互作用并产生一系列生物学效应的关键环节,参与细胞增殖、迁移与凋亡的调节过程。研究显示,黏着斑激酶表达及活化与肿瘤、心血管疾病密切相关,已成为生物学领域研究的热点及治疗的新靶点。

黏着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测黏着斑激酶相关性鸟苷三磷酸酶调节因子(GRAF)基因启动子甲基化。方法设计针对GRAF基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系,对不同DNA模板进行检测,评价方法的特异性、重复性和灵敏度;对10例急性髓系白血病(AML)标本进行检测。结果建立的MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;检测不同稀释度的甲基化阳性模板,其最大灵敏度可达2%;在不同时间进行MSP检测的结果均一致;对10例AML患者的初步检测发现7例存在着GRAF基因启动子甲基化。结论成功建立了检测GRAF基因启动子甲基化的MSP方法,有良好的特异性、灵敏度和重复性,可用于临床AML标本的批量检测。

黏着斑激酶对ERK介导的滋养层细胞侵袭行为的调节作用

目的:探讨黏着斑激酶(FAK)在细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路介导的滋养层细胞侵袭中的作用。方法:利用人绒毛外细胞滋养层(extravillous cytotropho-blasts,EVCT)细胞体外侵袭模型,加入不同浓度的黏着斑激酶抑制剂herbimycin A和ERK抑制剂PD98059,观察其对滋养层细胞生长的影响,FAK,ERK磷酸化的影响以及对滋养层细胞侵袭能力的影响。结果:Herbi-mycin A呈浓度依赖方式抑制EVCT细胞中磷酸化FAK的表达;herbimycin A能够部分抑制磷酸化ERK1/2表达,而PD98059对磷酸化FAK的表达未见影响;herbimycin A,PD98059均能不同程度地抑制EVCT细胞的体外侵袭作用。结论:ERK信号通路可能是多种侵袭信号的共同通路,其在滋养层细胞侵袭行为调节中起重要作用。

RGD多肽修饰多孔钽可激活MG63细胞整合素/黏着斑激酶信号通路

背景:在材料表面复合RGD多肽可诱导成骨细胞整合素基因的表达,促进成骨细胞黏附在生物材料的表面并分化成熟,促进新骨形成。目的:分析RGD多肽修饰国产多孔钽后对MG63细胞整合素/黏着斑激酶信号通路的影响。方法:制备RGD多肽修饰的多孔钽材料。将MG63细胞分别接种于多孔钽、RGD多肽修饰的多孔钽材料表面,以单纯培养的MG63细胞为空白组,培养1,3,5,7 d时,采用CCK-8法检测细胞增殖;培养1,3,5 d时,倒置显微镜下观察细胞生长状态;培养3,5 d时,扫描电镜观察细胞黏附;培养5 d时,采用Western-blot与RT-PCR法检测Ⅰ型胶原、整合素β1与黏着斑激酶表达。结果与结论:①RGD修饰组培养3,5,7 d的细胞增殖快于多孔钽组、空白组(P<0.05),多孔钽组各时间点细胞增殖与空白组比较差异无显著性意义(P>0.05);②倒置显微镜显示,培养1 d时,多孔钽组、RGD修饰组细胞贴附在材料边缘,细胞数量随着培养时间的延长逐渐增加,其中RGD修饰组细胞数量及密集程度优于多孔钽组;③扫描电镜显示,培养3 d时,多孔钽组、RGD修饰组材料表面均可见细胞黏附生长,细胞在材料孔壁及孔隙内黏附生长,伸出伪足嵌入孔洞内;5 d时,细胞分泌大量细胞外基质,细胞通过基质相互连接并逐渐覆盖材料表面,其中RGD修饰组细胞生长状态、基质分泌及细胞覆盖面积优于多孔钽组;④Western-blot检测显示,RGD修饰组Ⅰ型胶原、整合素β1蛋白表达高于多孔钽组、空白组(P<0.05),多孔钽组Ⅰ型胶原、整合素β1、黏着斑激酶蛋白表达高于空白组(P<0.05);⑤RT-PCR检测显示,RGD修饰组Ⅰ型胶原、整合素β1与黏着斑激酶mRNA表达高于多孔钽组、空白组(P<0.05),并且多孔钽组高于空白组(P<0.05);⑥结果表明,RGD多肽修饰多孔钽后可上调细胞膜上Ⅰ型胶原、整合素β1表达激活整合素/黏着斑激酶信号通路,促进细胞黏附、生长。