创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

背景:创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂,黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。目的:探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。方法:取20只SD大鼠制备股骨骨折模型。造模后5d,根据血栓形成情况将模型大鼠分为2组:血栓形成组和无血栓形成组,每组10只。另取10只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织,抽取总RNA,Genechip Rat Genome4302.0芯片测定股静脉RNA的表达,并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。结果与结论:与无血栓形成组比较,血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因均上调;下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血栓生物学状态的重要信号通路。

中药清肾颗粒对肾纤维化大鼠黏着斑激酶-Ras-丝裂素活化蛋白激酶信号转导通路的干预作用

目的：观察中药清肾颗粒对肾间质纤维化（RIF）大鼠肾组织黏着斑激酶-Ras-丝裂素活化蛋白激酶（FAK-Ras-MAPK）信号转导通路的影响。方法将40只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、百令胶囊组和清肾颗粒组，每组10只。采用单侧输尿管结扎（UUO）法制备RIF大鼠模型。术后百令胶囊组将百令胶囊溶于4 mL温水按0.3 g·kg-1·d-1灌胃；清肾颗粒组将清肾颗粒溶于4 mL温水按6 g·kg-1·d-1灌胃，正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。8周后检测各组大鼠血尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、纤维连接蛋白（FN）、α-肌动蛋白（α-SMA）水平；采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织FAK、Ras、p38MAPK、FN、α-SMA的表达水平。结果模型组大鼠血清BUN、SCr、FN、α-SMA水平高于正常对照组；清肾颗粒组和百令胶囊组给药前血清BUN、SCr水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；给药后两组BUN、SCr、FN、α-SMA均较模型组显著降低，且以清肾颗粒组降低更显著〔BUN（mmol/L）：13.18±4.91比18.56±5.59，SCr （μmol/L）：104.80±12.04比119.02±12.47，FN（mg/L）：29.72±16.75比46.38±8.63，α-SMA（kU/L）：5.49±2.68比7.13±2.37，均P＜0.05〕；免疫组化结果显示：模型组大鼠肾脏组织中FAK、Ras、p38MAPK及FN、α-SMA表达均高于正常对照组，清肾颗粒组和百令胶囊组上述各指标表达均较模型组显著降低，且以清肾颗粒组的下降程度更显著（FAK：3.00±1.41比5.28±2.21，FN：4.25±1.04比6.29±2.06，α-SMA：3.25±1.28比4.86±1.57， p38MAPK：2.50±1.31比4.71±2.50，Ras：3.50±1.41比4.29±1.38，均P＜0.05）。结论清肾颗粒可以降低RIF大鼠血清BUN、SCr水平，抑制肾脏内FAK-Ras-MAPK信号转导通路的活化，从而减少FN和α-SMA生成，发挥抗RIF作用。

金雀异黄酮抑制OPN-FAK信号通路对非小细胞肺癌迁移和侵袭的影响

目的:探讨金雀异黄酮(GS)抑制骨桥蛋白(OPN)/黏着斑激酶(FAK)信号通路对非小细胞肺癌(NSCLC)迁移和侵袭的影响。方法:qRT-PCR检测四种NSCLC细胞系(H596、H520、A549、H1703)及正常人肺上皮细胞(BEAS-2B)中OPN、FAK mRNA表达水平;以A549细胞为研究目标,分别设置对照组、GS低浓度(GS-L)组(10μmoL/L)、GS中浓度(GS-M)组(20μmoL/L)、GS高浓度(GS-H)组(40μmoL/L)、重组骨桥蛋白(rOPN)组(15ng/mL)、GS-H+rOPN组(40μmoL/L GS+15ng/mL rOPN)。分别利用MTT法、流式细胞仪检测上述各组细胞增殖率、凋亡率;划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移、侵袭变化;Western blot及qRT-PCR检测OPN/FAK信号通路相关基因和蛋白的表达。结果:与BEAS-2B细胞相比,A549细胞中OPN、FAK mRNA表达水平变化最为显著(P<0.05)。与对照组相比,GS-L组、GS-M组、GS-H组A549细胞增殖率、迁移率、侵袭及迁移数、OPN/FAK信号通路相关基因和蛋白表达显著降低,凋亡率显著增加(P<0.05);rOPN组A549细胞增殖率、迁移率、侵袭及迁移数、OPN/FAK信号通路相关基因和蛋白表达显著增加,凋亡率显著降低(P<0.05)。与GS-H组相比,GS-H+rOPN组A549细胞增殖率、迁移率、侵袭及迁移数、OPN/FAK信号通路相关基因和蛋白表达显著增加,凋亡率显著降低(P<0.05)。与rOPN组相比,GS-H+rOPN组A549细胞增殖率、迁移率、侵袭及迁移数、OPN/FAK信号通路相关基因和蛋白表达显著降低,凋亡率显著增加(P<0.05)。结论:GS可以抑制NSCLC-A549细胞的迁移、侵袭及增殖,促进其凋亡,可能与抑制OPN/FAK信号通路有关。

抑制黏着斑激酶-蛋白激酶B通路磷酸化对中心静脉导管留置诱导的兔颈外静脉损伤的保护作用

目的探讨抑制黏着斑激酶(FAK)-蛋白激酶B(Akt)通路磷酸化对中心静脉导管(CVC)留置诱导的兔颈外静脉损伤的保护作用及其机制。方法按照体重将新西兰兔随机分为3组:正常组、模型组和实验组,每组5只。经兔右颈外静脉插入CVC至右心房与上腔静脉交汇处,建立颈外静脉损伤模型。实验组用50μmol·L^(-1)的黏着斑激酶小分子抑制剂(Y15)溶液浸润CVC插管。插管后2,4和6周,苏木精-伊红染色观察颈外静脉病理改变,酶联免疫吸附法检测兔血清中活性氧簇(ROS)水平,蛋白质印迹法测定兔颈外静脉中磷酸化黏着斑激酶(p-FAK) Tyr 397的相对表达水平。结果干预4周后,模型组静脉腔内肉芽组织形成,大量炎细胞浸润;实验组血管内膜脱落。正常组、模型组和实验组的ROS水平分别为(32.65±1.97),(346.46±5.67)和(163.42±5.37)U·mL^(-1);这3组的p-FAK Tyr 397相对表达水平分别为0.13±0.02,3.41±0.04和0.49±0.03。模型组的上述指标与正常组比较、或实验组的上述指标与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论 Y15可减轻CVC留置诱导的颈外静脉损伤。

黏着斑激酶抑制剂Y15对中心静脉导管联合5-氟脲嘧啶诱导的细胞氧化损伤的作用机制研究

目的研究抑制黏着斑激酶(FAK)-蛋白激酶B(Akt)信号通路活化在减轻中心静脉导管(CVC)联合5-氟脲嘧啶(5-FU)诱导的血管内皮细胞氧化性损伤中的作用及其机制。方法将EA.hy926细胞随机分为3组:正常组、模型组和实验组,每组3个时间点:24,48,72 h,每个时间点8个复孔。模型组(CVCs+划痕+5-FU),细胞划痕后,放入截好的CVC节段3个,再加入5-FU(40μg·mL^-1),建立EA.hy926细胞氧化损伤模型;实验组在模型组基础上加入FAK抑制剂(Y15,50μmol·L^-1)。以噻唑蓝比色法检测各时间点(24,48,72 h)细胞活性(OD值),以2,7-二乙酸二氯荧光素检测细胞活性氧(ROS)水平,硝酸还原酶法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)含量,以蛋白质印迹法检测细胞中p-FAK Tyr 397和p-Akt Ser 473的表达水平(灰度值)。结果干预72 h后,正常组、模型组和实验组的细胞存活率分别为(94.80±3.27)%,(50.20±3.96)%和(71.00±2.92)%;这3组的ROS相对水平分别为(98.82±6.63)%,(469.83±19.60)%和(178.01±11.49)%;这3组的NO含量分别为(59.33±2.44),(22.10±2.57)和(43.39±2.58)μmol·L^-1;这3组的p-FAK Tyr 397相对表达水平为0.19±0.02,1.27±0.04和0.88±0.01;这3组的p-Akt Ser 473相对表达水平为0.14±0.02,1.17±0.04和1.05±0.09。上述指标:正常组与模型组比较、或实验组与模型组相比,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。结论抑制黏着斑激酶-蛋白激酶B信号通路活化能够减轻CVC联合5-FU诱导的EA.hy926细胞氧化损伤。

黏着斑激酶抑制药Y15在中心静脉导管联合5-氟尿嘧啶诱导的血管内皮细胞损伤中的抗炎作用

目的研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)抑制药(Y15)对中心静脉导管(central venous catheter,CVC)联合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导的血管内皮细胞损伤的抗炎作用及其机制。方法将EA.hy926细胞随机分为正常对照组、模型组和实验组。正常对照组用10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基2 mL培养细胞,无其他干预措施;模型组是用3道划痕(每道2 cm)、留置的3根CVC(1 cm)节断和1 mg·mL^(-1)5-FU 80μL共同诱导的细胞炎性损伤模型;模型组中加入2 mmol·L^(-1)Y1550μL,即为实验组。用实时荧光定量聚合酶链反应检测白细胞介素-6(interleulcin 6,IL-6)mRNA的表达水平,用蛋白质印迹法检测磷酸化黏着斑激酶Y397(phosphorylated focal adhesion kinase Y397,pY397 FAK)和核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表达水平。结果干预48 h后,正常对照组、模型组和实验组的IL-6 mRNA表达水平分别为1.07±0.11,5.34±0.65和1.58±0.13,pY397 FAK相对表达水平分别为0.20±0.04,1.27±0.04和0.74±0.03,NF-κB相对表达水平分别为0.32±0.02,1.72±0.07和1.05±0.14。实验组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.001)。结论FAK抑制药Y15通过调节FAK-NF-κB信号通路对CVC联合5-FU诱导的EA.hy926细胞损伤产生抗炎作用。

半夏泻心汤含药肠吸收液对胃癌微环境中PMN-MDSCs迁移侵袭的影响

目的:观察半夏泻心汤含药肠吸收液对胃癌微环境中多形核髓系来源抑制细胞(PMN-MDSCs)迁移侵袭的影响。方法:制备含生药量0.63 g·mL^(-1)的半夏泻心汤含药肠吸收液,以Transwell小室将胃癌细胞与PMN-MDSCs非接触共培养建立胃癌微环境模型,采用细胞增殖与活性检测-8(CCK-8)法筛选半夏泻心汤含药肠吸收液对PMN-MDSCs的最佳干预浓度及时间,用于后续实验,分为空白组、模型组、FAK抑制剂组及半夏泻心汤组(26%、18%、10%半夏泻心汤含药肠吸收液),采用细胞划痕实验和Transwell实验检测PMN-MDSCs的迁移和侵袭能力,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肿瘤微环境中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)细胞因子表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PMN-MDSCs通路相关蛋白局部黏着斑激酶(FAK)、磷酸化(p)-FAK、蛋白酪氨酸激酶(Src)、磷酸化(p)-Src蛋白表达水平。结果:与24 h比较,作用48 h 5%、50%、75%、100%半夏泻心汤含药肠吸收液对PMN-MDSCs的抑制率均有升高(P<0.05,P<0.01),与作用48 h比较,培养72 h 50%半夏泻心汤含药肠吸收液对PMN-MDSCs的抑制率低于48 h(P<0.01),5%、100%半夏泻心汤含药肠吸收液略高于48 h(P<0.05,P<0.01),其余浓度抑制率差异无统计学意义,且48 h半数抑制浓度(IC_(50))为18.09%,说明18%半夏泻心汤含药肠吸收液在48 h为最佳干预浓度及时间;与空白组比较,模型组PMN-MDSCs迁移距离显著增大(P<0.01),迁移及侵袭数量显著增多(P<0.01);与模型组比较,FAK抑制剂组、半夏泻心汤含药肠吸收液组PMN-MDSCs的迁移距离均显著减小(P<0.01),迁移及侵袭数量显著减少(P<0.01),以26%含药肠吸收液组最为显著(P<0.01);与空白组比较,模型组PMNMDSCs通路相关蛋白FAK、p-FAK、Src、p-Src表达显著升高(P<0.01),VEGF、MMP-9细胞因子表达均显著上升(P<0.01)。与模型组比较,FAK抑制剂组、半夏泻心汤含药肠吸收液组(26%、18%、10%)PMN-MDSCs FAK、p-FAK、Src蛋白表达降低(P<0.01),FAK抑制剂组、半夏泻心汤含药肠吸收液组(18%)p-Src蛋白表达显著降低(P<0.01),VEGF、MMP-9细胞因子表达显著降低(P<0.01)。结论:半夏泻心汤含药肠吸收液通过下调胃癌微环境PMN-MDSCs FAK信号通路蛋白FAK、p-FAK、Src、p-Src的表达,抑制PMN-MDSCs迁移侵袭。

肾癌索拉非尼耐药相关长链非编码RNA诱导骨肉瘤U2OS细胞侵袭和转移的机制

目的:探讨肾癌索拉非尼耐药相关长链非编码RNA(lncRNA-SRLR)对骨肉瘤U2OS细胞侵袭和转移的机制。方法:应用慢病毒空载对照(LV-NC)和慢病毒lncRNA-SRLR过表达载体(LV-over/SRLR)转染U2OS细胞,并建立细胞稳转株U2OS/NC和U2OS/SRLR。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测lncRNA-SRLR和赖氨酸羟化酶(PLOD2)mRNA的相对表达量。采用transwell和划痕实验检测细胞迁移和侵袭能力。采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测白细胞介素6(IL-6)的表达情况。采用荧光原位杂交技术(FISH)检测lncRNA-SRLR细胞定位。采用免疫荧光法检测PLOD2蛋白的表达情况。采用Western blot法检测PLOD2和FAK/STAT3通路相关蛋白的表达情况。结果:qRT-PCR检测结果显示,U2OS/NC和U2OS/SRLR细胞中lncRNA-SRLR mRNA的相对表达量分别为1.00±0.01和3 964.97±0.05,差异有统计学意义( P<0.001)。PLOD2 mRNA在U2OS/SRLR细胞中的表达量为2.77±0.11,明显高于对照U2OS/NC细胞(1.00±0.04, P<0.01)。划痕实验和侵袭实验均显示,U2OS/SRLR细胞的迁移和侵袭能力明显高于U20S/NC细胞( P<0.05)。ELISA法检测结果显示,U2OS/NC和U2OS/SRLR细胞上清液中IL-6的表达水平分别为(125.38±11.22)pg/ml和(119.97±13.43)pg/ml,差异无统计学意义( P>0.05)。免疫荧光检测结果显示,U2OS/SRLR细胞中PLOD2蛋白的表达明显高于U2OS/NC细胞。Western blot法检测结果显示,U2OS/SRLR细胞中PLOD2、p-FAK和p-STAT3等蛋白的相对表达量明显高于U2OS/NC细胞,差异有统计学意义( P<0.01)。 结论:lncRNA-SRLR可能通过作用于PLOD2,激活FAK/STAT3通路诱导了骨肉瘤U2OS细胞的侵袭和转移。