猪小肠黏膜下基质海绵的制备

背景:研究发现将小肠黏膜下基质直接应用于损伤部位,对体内外细胞的生长、分化还不是非常有效,而且其孔径很小,通透性不良,治疗效果不够理想。目的:构建小肠黏膜下基质海绵,了解其形态学特征。方法:采用物理及顺序化学浸泡脱细胞法制备猪小肠黏膜下基质。以不同质量分数的小肠黏膜下基质(1%、2%、3%、4%),不同浓度的交联剂EDC(50,100,150 mmol/L)制备小肠黏膜下基质海绵,光学显微镜及扫描电镜观察海绵结构。将小肠黏膜下基质海绵(实验组)与小肠黏膜下基质(对照组)分别置入大鼠背部肌肉中,置入1,2,3周后组织学观察组织反应及材料降解。结果与结论:(1)以质量分数1%小肠黏膜下基质、100 mmol/L EDC交联制得的小肠黏膜下基质海绵,空间结构弹性好,结构规整,孔径均匀一致,无空洞现象,所以肌肉置入实验选择此组材料;(2)置入1周后,实验组海绵网孔状结构保持完整,在材料周围可见轻微炎细胞浸润,少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞反应,支架边缘可见周围软组织增殖移行;对照组炎细胞浸润明显,其下创面有粘连,周围软组织增殖移行较少。置入3周后,实验组置入部位炎症基本消退,可见成纤维样细胞及血管成分,胶原纤维束较细小,平行排列,海绵处呈结缔组织样结构;对照组仍然存在炎性细胞浸润,胶原纤维含量较少;(3)结果表明:小肠黏膜下基质海绵结构合理,具备作为组织工程皮肤支架的潜能。

小肠黏膜下基质弹性模量的测定

目的对新型的生物衍生支架材料小肠黏膜下基质(smallintestinalsubmucosa,SIS)的弹性模量进行测定。方法用材料实验机对3只犬的21个SIS样本(每只犬各取7个)进行力学测试。沿管腔纵轴剖开SIS管壁,平行于管腔纵轴拉伸。经预调处理后进行正式拉伸实验,直至组织拉断,拉伸速度为5mm/min,测试温度为常温。结果21个样本测试后得到了应力-应变曲线,采用幂指函数σ=Kεα对应力-应变关系进行拟合,拟合曲线的平均相关系数R2达到0.9916,得到弹性模量表达式E=K1/ασ1-1/α。由实验得到α、K的平均值为3.9669和374.5500,由此得到E=4.3992σ0.75。结论弹性模量随应力增加而增加,变化规律与血管弹性模量变化规律一致。当σ取0.0133MPa(100mmHg)时,SIS的弹性模量约为0.1600MPa,与血管的弹性模量相似。

无细胞人膀胱黏膜下基质的生物相容性初探

目的探讨无细胞膀胱黏膜下基质(acellularurinarybladdersubmucosa,AUBS)的生物相容性。方法应用反复冻融-酶消化处理及冷冻干燥技术制备人AUBS。体外培养人口腔黏膜细胞,以2×106/ml密度接种于AUBS,观察细胞生长和增殖情况。取纯种SD大鼠18只,雌雄不限,体重250～300g。将AUBS1cm×1cm移植于大鼠腹部肌肉内,分别于术后3、6、10、14、21和28d各处死3只动物并取材进行组织学观察。结果AUBS主要由胶原纤维构成,呈三维立体网络状结构。第2代人口腔黏膜细胞接种于AUBS后能够生长和繁殖,10d后在AUBS表面形成了连续单层细胞结构。AUBS植入大鼠腹部肌肉内,术后6dAUBS移植区可见组织细胞浸润、生长,14d可见新生血管形成,28d胶原纤维排列规则。结论AUBS可以在体内、体外诱导细胞黏附和生长,生物相容性良好。

不同处理方法对骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下基质复合效果的影响

目的探讨不同处理方法对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)复合效果的影响。方法制备MSCs和SIS,将MSCs以不同浓度、不同接种次数与SIS复合,比较复合浓度、复合次数及复合时间对复合效果的影响。SIS用不同预湿方法处理后,将MSCs以2个浓度接种于预湿方法处理后的SIS上,比较不同的预处理方法对复合效果的影响。结果MSCs以2×106/mL与新法预处理的SIS复合后黏附率最高。MSCs与SIS复合后光学显微镜下可见SIS黏膜面有较多细胞附着,浆膜面几乎无细胞附着。扫描电镜可见细胞附着在SIS表面,呈长梭形或不规则形状,细胞表面可见颗粒状物及微绒毛。结论采用新的预湿方法,MSCs以2×106/mL的浓度与SIS复合1 d后用于移植,复合效果最佳。

小肠黏膜下基质修复大鼠皮肤缺损的实验研究

目的制备脱细胞小肠黏膜下基质,修补全层皮肤缺损,为组织工程皮肤的体外构建提供实验依据。方法制备小肠黏膜下层,用Wistar大鼠建立全层皮肤缺损的创伤模型,分成小肠黏膜下层组,络合碘凡士林纱条组以及空白对照组,于手术后分阶段取材,宏观观察及组织学观察以上3组大鼠愈合过程。结果肠黏膜下层贴附皮肤不引起排斥反应,无伤口感染,小肠黏膜下层组在愈合速度方面快于络合碘凡士林纱条,空白对照组最慢。小肠黏膜下层组愈合无瘢痕,皮肤附件生长良好,而其余两组瘢痕愈合,皮肤附件仅生长于伤口边缘处。结论小肠黏膜下基质的生物相容性良好,可以作为组织工程皮肤的细胞支架。

小肠黏膜下基质的力学特性

目的对新型的生物衍生支架材料小肠黏膜下基质(sm all intestinal submucosa,SIS)的弹性模量进行测定。方法利用电子式万能材料实验机对完成所有处理的犬小肠黏膜下基质进行纵向和横向拉伸实验。结果得到了应力-应变曲线,采用幂指函数σ=Kεα对应力-应变关系进行拟合,纵向拉伸组拟合曲线的平均相关系数R2达到0.991 6,横向拉伸组拟合曲线的平均相关系数R2为0.990 5,得到弹性模量表达式E=K1/ασ1-1/α。由实验得到纵向拉伸组α、K的平均值为3.966 9和374.55,横向拉伸组α、K的平均值为6.077 7和86.52,由此得到纵向拉伸组和横向拉伸组的弹性模量表达式分别为E=4.399 2σ0.75和E=2.082 8σ0.84。结论小肠黏膜下基质为一种各向异性的生物材料,弹性模量随应力增加而增加,变化规律与血管弹性模量变化规律一致。此外,当σ取0.013 33 MPa(100 mmHg)时,SIS的纵向弹性模量约为0.16 MPa,与血管的弹性模量相似。

抗小肠黏膜下基质修复组织后收缩的研究现状

小肠黏膜下基质（small intestinal submucosa，SIS）是指小肠黏膜下层组织经脱细胞处理后的细胞外基质．具有抗感染、无免疫原性等特性。

猪髋动脉内皮细胞与猪小肠黏膜下基质的联合培养

目的:将猪小肠黏膜下基质与猪髋动脉内皮细胞的复合培养,证实小肠黏膜下基质是否可以成为组织工程化血管的良好载体材料。方法:实验于2005-09/2006-01在同济大学生命科学与技术学院生物医学工程研究所完成了猪小肠黏膜下基质的制备与处理,在复旦大学医学院附属中山医院肿瘤中心完成了猪小肠黏膜下基质的射线照射及消毒,在同济大学生命科学与技术学院实验室完成了猪髋动脉内皮细胞与猪小肠黏膜下基质的复合培养。实验材料:猪小肠黏膜下基质取自屠宰场获取的新鲜家猪空肠,猪髋动脉内皮细胞(PIEC,中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)。实验分组:分为猪髋动脉内皮细胞单独培养组与猪小肠黏膜下基质-猪髋动脉内皮细胞复合培养组。实验方法:①小肠黏膜下基质采用物理和化学方法处理。②猪髋动脉内皮细胞单独培养。③猪小肠黏膜下基质-猪髋动脉内皮细胞复合培养。实验评估:采用倒置相差显微镜观察细胞的黏附和生长,猪小肠黏膜下基质的组织结构;测定单纯培养猪髋动脉内皮细胞和猪小肠黏膜下基质-猪髋动脉内皮细胞复合培养细胞的生长曲线,每日取3孔培养细胞经消化后细胞计数,取其均值,总共8日;以评价猪小肠黏膜下基质与猪髋动脉内皮细胞的细胞相容性。结果:①小肠黏膜下层表面形态:猪小肠黏膜下基质为浅白色薄膜状,厚度约80μm,光镜下可见处理后膜的上下两侧结构不同,一面较粗糙,孔径较大,用于细胞种植,另一面较平坦。单经物理方法处理后的猪小肠黏膜下基质表面有大量残留的细胞碎屑,再行化学处理后基质表面无细胞碎屑残留,胶原纤维未受损。②单独培养与复合培养的猪髋动脉内皮细胞形态对比:倒置显微镜观察,猪小肠黏膜下基质与猪髋动脉内皮细胞复合培养接种细胞24h贴壁,第1～4天时细胞增殖不明显,第5天有较多细胞直接贴附于材料边缘,随时间延长,猪髋动脉内皮细胞在猪小肠黏膜下基质表面黏附生长良好,细胞均匀分布于基质,细胞形态多为梭形及多角形。与猪髋动脉内皮细胞单独培养细胞相比,伪足不明显,细胞形态也相对规则。③细胞生长曲线:复合培养组的细胞计数前4d较单纯培养组少,第5天后时细胞计数高于单纯培养组,复合培养组在接种的后1d数量最少,两组细胞计数均在最后1d达到最大值。结论:猪髋动脉内皮细胞可在猪小肠黏膜下基质上黏附生长,猪小肠黏膜下基质可促进猪髋动脉内皮细胞的增殖,猪小肠黏膜下基质有良好的细胞相容性,其孔径、结构有助于猪髋动脉内皮细胞的黏附和生长,是良好的组织工程生物衍生材料。

剪切力对内皮细胞及其与小肠黏膜下基质复合培养的形态学影响

目的探讨切变应力对猪髋动脉内皮细胞单独培养和猪髋动脉内皮细胞与猪小肠黏膜下基质联合培养形态学特征的影响。方法对猪髋动脉内皮细胞单纯培养组,小肠黏膜下基质与猪髋动脉内皮细胞联合培养组均施与40×10-5N/cm2的剪切应力,持续12h,两组均每隔30min记录细胞图像,计算定向角。结果单纯培养组:第1小时可见有明显的细胞脱落,细胞形态变化不明显;第4小时,细胞脱落已不明显,细胞由多角形逐渐变圆;第8小时,看不到明显的细胞脱落,细胞由第4小时时的类圆形向长梭形发展,细胞变得细长,局部可见细胞沿流场方向排列;第12小时,细胞变得更加细长,细胞沿流场方向排列趋势更为明显;定向角第12小时时与剪切前相比有显著性差异。联合培养组:第1小时有少数细胞脱落,但不如单纯培养组第1小时细胞脱落明显;第2小时后看不到明显的细胞脱落;定向角在12h内未发生显著性变化。结论40×10-5N/cm2的脉动剪切力对猪髋动脉细胞的形态和排列在12h内产生影响;但对与猪小肠黏膜下基质复合培养的内皮细胞影响不大。

猪小肠黏膜下基质在组织重建中的研究进展

小肠黏膜下基质（small intestine submucosa,SIS）是一种不含细胞的天然细胞外基质材料。它有良好的细胞相容性,可促进多种细胞在材料上的黏附、生长和分化。在超过1 000次的跨种交叉移植实验中,均表现为无免疫原性,而且直接免疫激惹实验无应答反应。体内降解速度也较快。

小肠黏膜下基质用于胆管重建的研究

目的探讨在肝外胆管节段性缺失时，小肠黏膜下基质（SIS）用于重建胆管的可行性及相关机制，为胆道重建寻找新的思路。方法SIS制成管状，实验犬6条，胆总管节段性切除12—15mm，以SIS管桥接。分别于术后3、9周取材，通过胆道造影、病理等方法观察胆道重建过程和组织重构效果。结果存活率100％，胆瘘、胆道闭塞发生率为0。胆管收缩、狭窄现象普遍，长度收缩约（13．5±4．1）％。病理检查见胆管内膜细胞覆盖植入SIS段胆管，管壁由成纤维细胞构成，新生血管丰富。结论SIS材料制成管状用于替代胆管节段性缺失是可行的，可以避免胆漏，无管腔塌陷、闭塞。

小肠黏膜下基质复合口腔黏膜细胞和转染TIMP-1 siRNA的成纤维细胞用于尿道重建的实验研究

目的:探索应用小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)复合口腔黏膜细胞(oral keratinocytes,OK)和转染金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)siRNA的成纤维细胞(fibroblasts,FB)构建组织工程化尿道的可行性。方法:分离培养OK,FB,并用TIMP-1siRNA转染FB,检测转染前后FB分泌Ⅰ型胶原的改变。剥离24只雄性兔子腹侧尿道黏膜2.0cm×0.8cm,并将其平均分为3组,每组8只。第1组应用单纯SIS修复,第2组应用SIS复合OK修复,第3组应用SIS复合OK和转染TIMP-1siRNA的FB修复。术后1个月、6个月行逆行尿道造影检查和组织学分析评估三组尿道重建的效果。结果:转染TIMP-1siRNA的FB分泌Ⅰ型胶原明显减少。逆行尿道造影下,第1组兔子中有5只尿道管腔通畅,第2组有6只,第3组有7只。组织学上,第1组在1个月时形成了不完整的尿路上皮,在6个月时纤维化和炎症较明显。第2组和第3组在1个月时形成了完整的尿路上皮,在6个月时纤维化和炎症较轻,且第3组生长的尿路上皮、平滑肌和血管较第2组明显增多。结论:OK和转染TIMP-1siRNA的FB可作为尿道组织工程中的种子细胞用于尿道修复重建,OK和转染TIMP-1siRNA的FB可抑制尿道瘢痕的产生。

小肠黏膜下基质的特性及组织修复应用现状

小肠黏膜下基质以其抗感染、免疫原性低等特性已应用于基础及临床研究的多个领域，但其在部分组织修复中出现的收缩等问题较为普遍，且在一定程度上影响着被修复组织的功能恢复，因此，如何有效避免修复后收缩等不良效果仍是有待解决的问题。本文通过对小肠黏膜下基质特性及组织修复现状进行查阅和总结，尤其是对收缩等问题的提出，为进一步正确认识小肠黏膜下基质组织修复能力提供可靠依据。

冻干脱细胞膀胱黏膜下基质在尿道下裂修复中的临床应用

目的 在动物实验的基础上，将异体脱细胞膀胱黏膜下基质用于修复阴茎型尿道下裂患者，以初步了解其临床疗效。方法 我们采用反复冻融一酶法获得了同种异体人脱细胞膀胱黏膜下基质，于2004年将其试用于3例尿道下裂患者的治疗。结果 一期手术2例，尿线粗、直，无尿瘘，无散射；术后1年随访，阴茎无下弯，无尿痛、尿瘘，尿线粗，尿流测定仪及尿道镜检查未见异常。二期手术1例，远端尿道未见狭窄及闭锁。结论 同种异体脱细胞膀胱黏膜下基质是一种有前途的较为理想的尿道组织修复替代材料，远期效果还有待继续进行严密仔细的观察。

脱细胞膀胱黏膜下基质异种移植的实验研究

目的研究人脱细胞膀胱黏膜下基质(AUBS)异种移植的转归及免疫原性。方法将人AUBS异种移植于SD大鼠的腹壁肌肉内,分别于术后3、6、10、14、21和28 d取材进行组织学观察和FITC标记的山羊抗大鼠IgG免疫荧光染色观察。将人脱细胞真皮基质和未脱细胞膀胱黏膜下层作为对照进行对比观察。结果人AUBS可以诱导组织细胞浸润、生长,14 d内基质移植区血管化,28 d内移植基质被机体降解吸收。IgG免疫荧光染色观察显示,基质移植后局部无明显IgG免疫复合物的沉积。结论人AUBS植入大鼠腹壁肌肉后可以诱导组织细胞长入和血管化,并在新生组织形成过程中迅速降解吸收,不引起明显的免疫反应。

反复冻融-酶法制备脱细胞膀胱黏膜下基质

目的探讨脱细胞膀胱黏膜下基质的制备方法。方法分别采用反复冻融一酶法和除垢剂一酶法制备脱细胞膀胱黏膜下基质。将原代培养的口腔黏膜细胞接种于两种方法制备的脱细胞膀胱黏膜下基质上，观察细胞生长情况，接种14d后，对基质进行病理切片，皿染色观察。结果口腔黏膜细胞可在反复冻融一酶法制备的脱细胞膀胱黏膜下基质上生长，并形成连续单层细胞。除垢剂一酶法制备的脱细胞膀胱黏膜下基质上无细胞生长。结论反复冻融．酶法可制备适于细胞黏附生长的脱细胞膀胱黏膜下基质。

小肠黏膜下层复合上皮细胞及成肌细胞构建组织工程食管的初步研究

目的初步探索利用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）作为支架材料，复合食管鳞状上皮细胞与成肌细胞构建组织工程食管的可行性。方法4周龄无胸腺小鼠20只，体重20．0±2．5g，雌雄不限。体外分离、培养人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞，并行5-BrdU标记；制备SIS材料并切割成1cm×lcm大小，在SIS材料同一表面接种两种细胞，待细胞在材料表面贴附后将其植入裸鼠体内深筋膜下，于术后第3天及l、2、3周取材行组织学和抗角蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA）免疫组织化学观察，以了解食管鳞状上皮细胞、成肌细胞在SIS材料上的增殖、分化情况和复合物在裸鼠体内的血管化情况。结果人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞能够渗透、生长于SIS材料中，并形成数层结构。植入体内第3天可见细胞增殖为多层覆盖于材料表面，并分泌大量细胞间基质。第2周时已经形成7～8层细胞，并伴有血管长入。3周时细胞增殖为十几层，大量血管长入。通过5-BrdU标记抗体染色观察，示SIS支架材料上生长的细胞多为所植入细胞。抗角蛋白，SMA免疫组织化学染色示移植细胞能够在体内分化。结论成肌细胞与鳞状上皮细胞在SIS材料上的复合培养物，在体内能继续增殖分化形成多层细胞结构，并能快速血管化，可用于组织工程化食管的构建。

IL-10活化M2c型巨噬细胞抑制SIS植入机体后收缩的研究

目的:探讨IL-10能否通过活化M2c型巨噬细胞抑制小肠黏膜下基质(SIS)植入机体后收缩。方法:40只SD大鼠随机分为4组每组10只。背部各植入1片2.0 cm×2.0cm的4层SIS补片。根据术后尾静脉注射IL-10浓度,分为40μL/kg组、20μL/kg组、10μL/kg组及生理盐水对照组,每组于术后1、4周各处死5只,用毫米尺测量SIS植入机体后收缩率,并用病理方法检测SIS降解重构效果及M1型巨噬细胞、M2c型巨噬细胞的表达情况。结果:术后1周各组未见明显区别(P>0.05);4周时10μL/kg组与生理盐水对照组未见明显区别(P>0.05),40μL/kg组、20μL/kg组较生理盐水对照组明显抑制SIS植入机体后收缩(P<0.05),且IL-10剂量越大,其作用越明显(P<0.05)。术后4周40μL/kg组、20μL/kg组、10μL/kg组及生理盐水对照组收缩率分别为(27.80±1.09)%、(39.50±0.89)%、(57.60±2.30)%、(58.00±1.46)%;量化计分,术后4周以上4组CD16含量(M1型巨噬细胞数)分别为20.00±0.47、27.10±1.42、35.12±0.83、35.20±0.76,CD163含量(M2c型巨噬细胞数)分别为86.60±1.30、70.60±1.80、55.96±1.05、55.80±1.14。结论:IL-10能通过活化M2c型巨噬细胞,发挥抑制SIS植入机体后收缩的作用。

IL-10/JAK1/STAT3通路对SIS转归影响的体内实验研究

目的:探讨白细胞介素(interleukin,IL)10能否通过激活JAK1/STAT3通路抑制小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)收缩,为SIS更好地修复组织功能缺损寻找新思路。方法:大鼠背部植入2.0 cm×2.0 cm的4层SIS补片。60只SD大鼠随机分为4组(n=15):IL-10组、S3I-201(IL-10下游通路阻断剂)组、IL-10+S3I-201组和生理盐水对照组。术后1、4、8周每组各处死5只。通过毫米尺测量SIS面积后计算其收缩率。HE染色及免疫组织化学法检测SIS中信号转导及转录活化因子(signal transducers and activator of transcription,STAT)3、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和α平滑肌肌动蛋白(alphasmooth muscle actin,α-SMA)表达与含量。结果 :术后第1周各组SIS收缩率、STAT3、MMP2、VEGF及α-SMA表达无统计学差异(P>0.05)。与对照组比较,第4、8周IL-10可明显抑制SIS收缩、增加STAT3通路激活数、促进SIS降解及新生血管生成、抑制肌成纤维细胞生成(P<0.05)。S3I-201可对抗IL-10的以上作用(P<0.05)。经测量,术后8周IL-10组、S3I-201组和IL-10+S3I-201组收缩率分别为(39.8±1.0)%、(84.3±0.8)%、(69.8±0.6)%。量化计分,8周时3组STAT3含量分别为22.3±1.4、9.2±0.9、15.4±1.0;MMP2含量分别为25.0±1.0、9.4±0.8、15.0±0.6;VEGF含量分别为17.5±0.4、4.7±0.4、9.1±0.5;α-SMA含量分别为31.4±0.5、85.6±0.7、47.8±0.8。结论 :IL-10通过激活JAK1/STAT3通路,促进外源性胶原基质降解、新生血管生成及减少肌成纤维细胞生成,发挥抑制SIS修复组织收缩的作用。

交联与非交联猪源生物补片对绵羊肌源性干细胞生长影响的研究

目的探讨交联与非交联猪源生物补片(P型和S型)对绵羊肌源性干细胞(muscle derived stem cell,MDSC)生长的影响。方法利用二次沉淀法在体外将绵羊MDSC种植于各型猪源生物补片表面,并利用CCK-8法检测绵羊MDSC在异种生物补片表面生长情况。结果 CCK-8法检测表明绵羊MDSC在猪源生物补片表面生长良好,且在非交联猪源生物补片表面生长状况优于交联生物补片。结论二次沉淀法可有效的将绵羊MDSC接种于猪源生物补片(P型和S型)上,且非交联猪源生物补片更适于MDSC生长。