黏膜佐剂mLT63及CpG-ODN鼻内免疫的佐剂作用

目的研究大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63和CpG-ODN鼻内免疫对抗原的佐剂效应。方法选用破伤风类毒素(TT)和小牛血清白蛋白(BSA)为抗原,mLT63和CpG-ODN为佐剂,经鼻内免疫BALB/c小鼠。ELISA间接法检测免疫小鼠血清和肺、直肠及阴道组织萃取液的特异性抗TT、BSA的IgA、IgG水平。结果mLT63和CpG-ODN均能协助TT和BSA抗原在血清、肺、阴道、直肠组织中诱导出高滴度的IgG抗体。在血清中IgA抗体滴度均比较低,而TT-IgA在肺和阴道组织中滴度较高,BSA-IgA在肺组织中滴度较高。各佐剂组之间IgG和IgA抗体水平相比,差异均无显著意义。不同剂量的mLT63诱导的BSA-IgA抗体水平差异无显著意义。结论mLT63和CpG-ODN经鼻内免疫对TT和BSA抗原均有良好的佐剂作用。

黏膜佐剂研究进展

近来,人们把很大精力用于比现有疫苗更安全、更有效的亚单位疫苗的研究,期待以此来取代现有的全细胞或甲醛灭活的疫苗,包括研究其它一些用于开发替代传统疫苗的递送方式如植物源疫苗的经黏膜(经口)递送方式.……

黏膜佐剂鼻内免疫抗旋毛虫感染作用的探讨

目的 研究黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位(CT-B)经鼻内免疫诱发旋毛虫感染的黏膜免疫。方法 24只NIH小鼠随机分为四组,即:①CT-B免疫组(CT-B);②正常对照组(C);③CT-B免疫感染组(CT-B+INF);④单纯感染组(INF)。CT-B组和CT-B+INF组每周经鼻免疫1次(幼虫抗原100μg、CT-B10μg),共3次,末次免疫后1周,CT-B+INF组和INF组同时给予200条旋毛虫幼虫攻击感染,感染后一周,检查小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力。CT-B组与C组于CT-B组末次免疫后7日,CT-B+INF组与INF组于攻击感染后7日,对各组小鼠血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG),肠黏液分泌型免疫球蛋白A(sIgA)进行比较。结果 与单纯感染组相比,CT-B+INF组肠道成虫数明显减少,雌虫生殖力明显降低,成虫与新生幼虫减虫率分别为89.95％和74.93％。CT-B+INF小鼠肠黏液sIgA、血清IgA较对照组小鼠明显提高(0.29±0.07vs0.09±0.02,0.25±0.09vs0.08±0.01,P<0.001);而两组IgG1和IgG2b水平无显著性差异(P>0.05)。CT-B+INF组小鼠肠黏液sIgA、血清IgA较INF组小鼠相比有显著性差异(0.78±0.25vs0.08±0.15,0.42±0.10vs0.10±0.10,P<0.001),而两组IgG1和IgG2b水平无显著性差异(P>0.05)。结论 本研究显示CT-B不仅能提高局部黏膜sIgA水平诱导局部免疫应答,还能提高IgA水平诱导全身?

壳聚糖黏膜佐剂促进黏膜免疫的研究进展

近年来通过黏膜部位释放抗原物质的新型免疫方法受到了越来越多的关注,其中鼻腔免疫被认为是最有前景的给药途径,佐剂可以提高或优化对通过黏膜或系统途径接种抗原的免疫应答,新的黏膜佐剂和传递系统是疫苗领域的研究热点。本文就纳米载体-壳聚糖作为特殊的黏膜免疫佐剂和PEG交联壳聚糖季铵盐智能水凝胶体系作为新型的鼻腔免疫传递系统作一综述。

霍乱毒素作为黏膜佐剂的研究进展

霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,既是强黏膜免疫原,又具有很强的黏膜佐剂活性,是当今研究最多且最深入的黏膜免疫佐剂之一。然而,由于CT其毒性,限制了在人体的使用。很多研究致力于使CT的佐剂性与毒性分离,CT亚基的佐剂性的研究就是方向之一。困扰黏膜疫苗的一个重要问题是很多抗原的黏膜免疫原性较弱,不能刺激有效的免疫反应,这也与黏膜免疫耐受有关,以CT为佐剂能消除机体对这些共免疫原的耐受。

重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2联合IL-2、IFN-γ佐剂鼻内免疫小鼠诱导的小肠黏膜免疫应答

为探讨IL-2和IFN-γ的佐剂效应，本研究观察了重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2（rTgPGAM2）联合IL-2或IFN-γ滴鼻免疫小鼠诱导小肠黏膜IgA抗体分泌细胞（IgA—ASCs）和小肠冲洗液sIgA的免疫应答。将48只6周龄雌性BALB／c小鼠随机均分为6组，免疫组分别用500IUIL-2、1000UIFN-γ、30μgrTgPGAM2、30μgrTgPGAM2＋500IUIL-2或30μgrTgPGAM24-1000UIFN-1滴鼻免疫小鼠，抗原和佐剂溶于20μLPBS中，对照组用20μLPBS滴鼻。免疫3次，一免和二免间隔2周，二免后1周三免。三免后第14天，颈椎脱臼处死小鼠，免疫组化检测小鼠十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA-ASCs，计算阳性率，ELISA测定小肠冲洗液sIgA水平。结果表明，免疫组十二指肠、空肠和回肠黏膜中IgA—ASCs阳性率高于PBS组，其中rTgPGAM2、rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组差异显著（P〈0．05或P〈0．01）。rTgPGAM2联合IL-2或IFN-γ佐剂组小肠冲洗液sIgA水平显著高于PBS组（P〈0．01）。rTgPGAM2、TgPGAM2＋IL-2和TgPGAM2＋IFN-γ滴鼻免疫小鼠均可有效诱导肠黏膜免疫应答，IL-2和IFN-γ可显著增强抗原的免疫效应，IL-2的佐剂效应优于IFN-γ。

通用黏膜免疫佐剂的制备

目的采用同源重组技术制备通用黏膜佐剂。方法将枯草芽胞杆菌CotB基因与融合基因AB连接后插入整合质粒pDG1662得到重组质粒pDG1662-CotB-AB,电转化法将线性化重组质粒转化枯草芽胞杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、免疫荧光法鉴定免疫球蛋白结合蛋白基因重组及蛋白表达情况。结果 AB基因成功重组入枯草芽胞杆菌基因组中,免疫球蛋白结合蛋白在芽胞表面得到了有效表达,并具有结合免疫球蛋白的生物活性。结论本研究成功制备了黏膜免疫佐剂。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。

黏膜传递系统和黏膜佐剂研究进展

黏膜传递系统和佐剂被认为是疫苗的重要组成部分。多年来，这一领域的研究不断深化，包括作为传递系统的重组减毒活细菌或病毒、质粒DNA、脂质体，以及霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素等传统的黏膜佐剂。但由于这些物质存在着毒副作用等局限性，新的更加有效和安全、经济的黏膜传递系统和佐剂一直是人们探索的目标。本文拟对一些近年有关菌影、芽孢等新的黏膜传递系统以及ADP核糖基化肠毒素类佐剂及单磷酰脂质A、CpG-ODN等佐剂新的进展简介如下。

基于不同黏膜佐剂的艰难梭菌类毒素B疫苗微针经皮免疫效应研究

目的探索基于不同黏膜佐剂的艰难梭菌类毒素B(Clostridium difficile toxoid B,CdtB)疫苗的微针经皮免疫效果,为艰难梭菌感染的防治提供思路。方法纯化的艰难梭菌B毒素(TcdB)经甲醛脱毒制备成CdtB疫苗,采用不同剂量的疫苗单独或加入黏膜佐剂的方法,于0 d、7 d、14 d、28 d、42 d微针经皮免疫雌性BALB/c小鼠,定期检测小鼠特异性血清IgG和粪便中IgA的效价水平变化,通过细胞中和试验和艰难梭菌人工感染免疫小鼠的方法来评价疫苗的免疫保护效果。结果(1)CdtB疫苗单独微针免疫小鼠后,随着剂量与免疫次数的增加,产生了较好的血清特异性抗体IgG,粪便中也出现较高水平的IgA;(2)用含有热不稳定肠毒素(LT)佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)佐剂的CdtB微针免疫小鼠,各组的血清特异性IgG效价趋势随着免疫剂量增加而提高,含有LT佐剂的免疫组效价变化趋势明显较好;与不加佐剂组比较,各组粪便中特异性IgA效价抗体水平变化趋势差异有统计学意义,但佐剂效应不明显;(3)分别用10μg CdtB单独微针免疫小鼠和腹腔注射小鼠,虽然微针免疫与腹腔注射后小鼠血清IgG效价差别不大,但微针免疫可明显提高粪便中特异性IgA水平;(4)细胞中和试验和小鼠攻毒保护试验结果说明CdtB疫苗微针免疫可产生一定的保护效力。结论CdtB疫苗微针经皮免疫小鼠的黏膜免疫效果较好,黏膜佐剂LT和CTB对CdtB疫苗的微针经皮免疫的佐剂效应不显著。

暴露N端对趋化因子LTN黏膜佐剂作用的影响

我们前期构建了编码CVB3结构蛋白VP1的真核表达质粒(pVP1),通过滴鼻免疫诱导了一定水平的细胞和体液免疫应答。为了进一步增强其免疫效果,我们在该黏膜疫苗中引入新型黏膜佐剂LTN,发现当两种质粒共免疫时可显著增强pVP1诱导的CVB3特异性血清IgG和黏膜IgA水平,促进脾脏及黏膜局部IFN-γ+T细胞产生,显著减轻CVB3感染小鼠心肌病理损伤。随后我们对该疫苗体系进行了优化,使用双顺反子形式将编码VP1和LTN的基因构建在同一质粒上,通过滴鼻免疫小鼠后同样获得了免疫增强作用;当尝试将LTN N端融合至VP1蛋白,以该融合质粒pVP1-LTN滴鼻免疫小鼠后发现其增强免疫应答的能力显著下降;为排除融合蛋白空间构象改变及空间位阻对LTN佐剂功能的影响,我们在蛋白连接处引入柔性接头肽段(G4S)3,构建了融合质粒pVP1-IRES-LTN,发现该疫苗增强全身及黏膜局部特异性抗体细胞免疫应答的能力也非常有限,与pVP1-LTN相比并无明显差异,因此不能有效清除心肌病毒和减轻心肌损伤,提示融合蛋白的空间位阻或构像改变并非是影响LTN佐剂效应的关键因素,而暴露的LTN N端对其增强全身及黏膜局部免疫应答强度、提高心肌炎的免疫保护作用十分关键。

蛋白体黏膜佐剂的研究进展

蛋白体是脑膜炎球菌外膜蛋白形成的疏水性的毫微粒囊泡状结构,可以安全有效的提高脂多糖,蛋白和多肽等多种抗原疫苗的免疫原性。迄今为止,很多研究显示蛋白体黏膜佐剂的优势潜能。作者检索了近年来国内外关于蛋白体作为免疫佐剂的相关文献,并进行分析、归纳。本文综述了蛋白体的结构、作用机理以及国内外作为黏膜佐剂的研究进展。

几种黏膜免疫佐剂对鸡小肠IgA分泌细胞的影响

分别在新城疫Ⅳ系弱毒苗中添加黏膜免疫佐剂乳酸杆菌、CpG DNA、重组IL-2、氟化钠和大豆黄酮,经口免疫鸡后,研究十二指肠、空肠、Peyer’s斑单位面积IgA分泌细胞的变化。首先提纯鸡IgA和制备兔抗鸡IgA血清,然后应用免疫组化技术显示鸡小肠IgA分泌细胞。结果表明,在免疫后第3周、第5周乳酸杆菌组比新城疫组(ND)极显著增加各段小肠IgA分泌细胞的数量(P<0.01);CpG DNA、重组IL-2和大豆黄酮在整个免疫期内均明显增加鸡小肠黏膜局部IgA分泌细胞数量;NaF对鸡体黏膜局部IgA分泌细胞数量无明显增加。结果表明乳酸杆菌、CpG DNA、重组IL-2和大豆黄酮是有效的口服黏膜免疫佐剂。

黏膜免疫佐剂及免疫途径研究进展

黏膜是病原体入侵的主要门户,黏膜表面有高度集中的淋巴组织,一个黏膜部位的免疫反应可以诱发所有黏膜效应组织免疫反应的出现。黏膜免疫还可以诱导全身免疫应答,是目前疫苗研究的新方向,但黏膜免疫佐剂及免疫途径的发展制约着黏膜免疫的效果。文章对黏膜免疫佐剂及其途径进行了综述。

大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂的研究进展

免疫佐剂是一类通过刺激机体免疫系统而非特异性地增强机体对抗原免疫应答的活性物质,也是近年来研究的热点。免疫佐剂种类众多,利用细菌及其代谢产物作为黏膜免疫佐剂具有很好的发展前景,研究较多的是霍乱毒素(CT)和大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT),从研究效果看,LT比CT更为理想。但是LT和CT一样本身具有毒性,这是其作为黏膜佐剂的主要缺点。目前,国内外研究工作者对其突变体做了大量研究,以期找到具有黏膜佐剂活性但低毒或无毒的大肠埃希菌不耐热肠毒素突变体。文章对大肠埃希菌不耐热肠毒素分子及其突变体的研究做一综述。

复合黏膜免疫佐剂对鸡小肠细胞免疫的影响

分别应用复合黏膜免疫佐剂Ⅰ和Ⅱ与新城疫Ⅳ系弱毒苗混合(佐剂Ⅰ组和佐剂Ⅱ组),经口免疫鸡后,研究鸡小肠黏膜局部CD3+T细胞、上皮内淋巴细胞和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)mRNA表达水平的变化。结果表明,在整个免疫期内CD3+T细胞和上皮内淋巴细胞数量都呈上升趋势,在首免后第3和第5周时十二指肠CD3+T细胞佐剂Ⅱ组比佐剂Ⅰ组显著增加(P<0.05),空肠CD3+T细胞佐剂Ⅱ组比佐剂Ⅰ组极显著增加(P<0.01),第7周时Peyer’s斑上皮内淋巴细胞佐剂Ⅱ组比佐剂Ⅰ组极显著增加(P<0.01);整个免疫期内佐剂Ⅱ组和佐剂Ⅰ组IFN-γmRNA表达水平呈下降趋势,表达量较低。本研究表明2种复合黏膜免疫佐剂都能明显增加黏膜局部免疫细胞的数量,提高小肠局部黏膜免疫力。

几种黏膜免疫佐剂对小肠树突状细胞、MHCⅡ类分子及核转录因子NF-kB的影响

目的研究黏膜免疫佐剂在小肠局部的抗原递呈方式和信号转导途径。方法应用大鼠肠道原位结扎灌注模型观察大豆黄酮、CpGDNA和乳酸杆菌3种黏膜免疫佐剂对树突状细胞、MHCⅡ类分子和核转录因子NF-κB的影响。结果1)CpGDNA和乳酸杆菌能够显著增加小肠树突状细胞的面积,促进局部疫苗抗原的递呈;2)大豆黄酮、CpGDNA和乳酸杆菌能在24h内促进大鼠空肠MHCⅡ类分子的显著表达。提示黏膜免疫佐剂可能通过增强黏膜局部抗原递呈细胞的活性和MHCⅡ类分子的含量促进局部特异性免疫反应;3)CpGDNA可以在24h内显著增加细胞内NF-κB蛋白的含量,在0.25h作用最明显;乳酸杆菌在6h内可极显著增加NF-κB蛋白的表达;而大豆黄酮对细胞内NF-κB蛋白的含量作用不明显。结论提示细菌类佐剂CpGDNA和乳酸杆菌是通过活化NF-κB途径激发免疫活性细胞,大豆黄酮可能不通过该途径。

黏膜免疫系统及黏膜免疫佐剂的研究进展

目的探讨黏膜免疫基本机理以及黏膜免疫佐剂在增强黏膜免疫效果方面的作用。方法通过查找大量的国内外相关文献,分析归纳国内外目前研究现状。结果通过黏膜接种疫苗可有效地诱导黏膜局部免疫及系统免疫应答,并产生相应的保护性抗体。黏膜免疫佐剂的应用能够增强免疫效果,不同的黏膜免疫佐剂其机理也各不相同,应用方法也有所不同。结论通过黏膜接种疫苗可产生保护性抗体,不同的黏膜免疫佐剂的应用可增强黏膜免疫接种的效果。