通用黏膜免疫佐剂的制备

目的采用同源重组技术制备通用黏膜佐剂。方法将枯草芽胞杆菌CotB基因与融合基因AB连接后插入整合质粒pDG1662得到重组质粒pDG1662-CotB-AB,电转化法将线性化重组质粒转化枯草芽胞杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、免疫荧光法鉴定免疫球蛋白结合蛋白基因重组及蛋白表达情况。结果 AB基因成功重组入枯草芽胞杆菌基因组中,免疫球蛋白结合蛋白在芽胞表面得到了有效表达,并具有结合免疫球蛋白的生物活性。结论本研究成功制备了黏膜免疫佐剂。

枯草芽孢杆菌芽孢佐剂免疫途径及效果的动物实验观察

目的探讨以表面展示免疫球蛋白结合蛋白功能域(FDIBP)的枯草芽孢杆菌芽孢制备的黏膜佐剂不同途径免疫的应用效果。方法分别将表面展示FDIBP的重组枯草芽孢杆菌芽孢及大肠杆菌不耐热毒素(LT)与人IgG(hIgG)作为佐剂共孵育制备疫苗,通过灌胃、滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,5周后收集外周血、肺泡、小肠及阴道冲洗液。采用ELISA方法检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、抗hIgG特异性IgG抗体,同时检测血清及肺泡、小肠、阴道冲洗液中抗hIgG特异性IgA抗体水平。结果与无佐剂免疫者比较,枯草芽孢杆菌芽孢佐剂滴鼻能有效提高小鼠体液免疫产生的抗原特异性抗体IgA及IgG水平(P<0.01),但未能有效刺激细胞免疫上调血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平;通过灌胃途径免疫者上述特异性抗体及细胞因子水平均无显著变化(P均>0.05)。结论展示FDIBP的枯草芽孢杆菌芽孢可用作滴鼻途径黏膜疫苗佐剂,能有效刺激机体产生特异性黏膜免疫反应。

基因疫苗黏膜免疫及其机制的研究进展

基因疫苗是将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体质粒上,然后将重组质粒直接导入人或动物体内,让其在宿主细胞中表达抗原蛋白,诱导机体产生免疫应答。以达到预防疾病的目的。现已证实基因疫苗的有效性及安全性,

JY佐剂对人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒黏膜免疫效果的影响

目的探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白病毒样颗粒(Virus-like parti-cle,VLP)黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。方法用含或不含JY佐剂的HPV18 L1 VLP分别经肌肉和鼻腔免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,ELISA法检测血清IgG抗体滴度;于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,采用IFNγELISPOT试剂盒检测细胞免疫效果,ELISA法检测黏膜免疫效果;鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,每次间隔3周,收集第14、20、26、32和38周的血清,ELISA法检测HPV18 L1蛋白与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。结果免疫3次后,不含或含有佐剂的HPV18 L1蛋白经肌肉免疫后的血清IgG抗体滴度(均为104.6)高于经鼻腔免疫后的血清IgG抗体滴度(分别为101.9和102.8)。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后呼吸道灌洗液中sIgA抗体浓度(30.06μg/ml)明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(23.47μg/ml)(P<0.01),但肌肉免疫组未检测到sIgA抗体。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫诱导的细胞斑点数明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(P<0.01),不含佐剂与含佐剂的HPV18 L1蛋白肌肉免疫组诱导的细胞斑点数差异无统计学意义(P>0.05)。HPV18 L1免疫小鼠后的血清与HPV58、11和6型之间均有交叉反应,在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。结论 HPV18 L1 VLP经肌肉免疫后,其血清抗体水平高于鼻腔免疫组,但该蛋白鼻腔免疫后细胞免疫反应和黏膜sIgA抗体水平均高于肌肉免疫组;JY佐剂能增强HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后的小鼠细胞反应及黏膜sIgA抗体应答,但肌肉免疫组佐剂作用不明显;HPV18 L1蛋白反复鼻腔免疫后,可拓宽抗原保护谱。

蛋白体黏膜佐剂的研究进展

蛋白体是脑膜炎球菌外膜蛋白形成的疏水性的毫微粒囊泡状结构,可以安全有效的提高脂多糖,蛋白和多肽等多种抗原疫苗的免疫原性。迄今为止,很多研究显示蛋白体黏膜佐剂的优势潜能。作者检索了近年来国内外关于蛋白体作为免疫佐剂的相关文献,并进行分析、归纳。本文综述了蛋白体的结构、作用机理以及国内外作为黏膜佐剂的研究进展。

猪瘟疫苗冻干保护剂的筛选及免疫效果评价

为了筛选耐热性能好、能提高猪瘟病毒(SFV)疫苗经口服途径免疫效果的冻干保护剂,配比不同组分的冻干保护剂与黏膜佐剂LTRG蛋白、SFV按比例混合,通过对冻干工艺的优化,制备了4种.SFV的冻干苗;口服免疫小鼠,测定血清IgG和粘膜IgA抗体效价。结果表明:试验2组即甘氨酸+明胶组和试验4组即明胶组的外观形态较好,水溶后呈现澄清的状态;试验2组和试验4组的冻干苗经口服免疫,诱导小鼠产生的IgG抗体水平显著高于SFV组、SFV+LT组及其他试验组(P<0.01)。二免7 d试验2组小鼠肛试子IgA抗体显著高于其他组(P<0.01),且小鼠脾脏IFN-γ和IL-4细胞因子的表达量也极显著高于其他组(P<0.01)。研究初步筛选出第2组配方,即以甘氨酸和明胶配伍作为猪瘟口服疫苗冻干保护剂,为研制口服途径免疫的猪瘟疫苗奠定了基础。

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究

目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)中,再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB。用KEGEN TRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RT-PCR产物序列分析、Western blot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。

黏膜免疫佐剂与多糖结合疫苗的研究进展

机体95％以上的感染发生在黏膜或由黏膜入侵机体。目前对人类生命与健康危害极大和难以防治的重要传染病，多起源于黏膜表面。传统疫苗大多是采用肌肉或皮下注射等方式，与大多数病原的自然感染途径不同，在诱发全身免疫的同时，难以产生有效的黏膜局部免疫应答。而黏膜投递途径简单、安全，避免了注射疫苗所需的严格标准，有利于开展大规模人群的免疫接种^[1]。本文将结合本实验室从事黏膜投递型多糖一蛋白结合疫苗研究的一些体会，着重对黏膜免疫的特点、优势及最新进展和发展黏膜投递型多糖结合疫苗的可能性进行综述，为新型疫苗的研究提供参考。

嵌合鞭毛蛋白和壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶封装对鼻接种幽门螺杆菌黏附素诱导的免疫应答的佐剂作用

【目的】幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)是幽门螺杆菌疫苗的一种有希望的抗原。探索嵌合鞭毛蛋白(cFLN)和壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶包封对鼻递送抗原HpaA诱导的免疫应答增强的佐剂作用。【方法】通过将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的D0、D1结构域与幽门螺杆菌鞭毛FlaA的D2、D3结构域相结合,构建嵌合鞭毛蛋白cFLN。作为分子内佐剂,嵌合鞭毛蛋白cFLN与黏附素(HpaA)连接构建复合抗原cFLN-HpaA。cFLN、HpaA、cFLN-HpaA在重组大肠杆菌中表达,并通过Ni-NTA预装色谱柱进行纯化。使用离子凝胶法分别将cFLN、HpaA、cFLN-HpaA包封到壳聚糖/三聚磷酸(CS/TPP)纳米凝胶中。【结果】成功表达和纯化了cFLN、HpaA和cFLN-HpaA,并用离子凝胶法将这3种抗原包封在CS/TPP/纳米凝胶中,制备了包封cFLN的CS/TPP纳米凝胶(cFLN-HpaA NG)、包封HpaA的CS/TPP纳米凝胶(HpaA NG)、包封cFLN-HpaA的CS/TPP/纳米凝胶(cFLN-HpaA NG)。经鼻免疫小鼠后,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别导致血清中IgG、IgG1和IgA含量增加2.09倍、1.4倍和2.62倍。与cFLN、HpaA和cFLN-HpaA相比,cFLN NG、HpaA NG和cFLN-HpaA NG分别使血清中IgA、IgG、IgG1和IgG2a的含量增加了1.28至1.71倍。【结论】cFLN和CS/TPP NG可以显著增强鼻腔输送的HpaA诱导的体液免疫。通过检测鼻腔免疫后胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量,与HpaA相比,cFLN-HpaA分别诱导IFN-γ、IL-4和SIgA的含量增加1.38、1.16和1.58倍。与cFLN-HpaA相比,cFLN-HpaA NG分别使小鼠胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17和SIgA的含量增加1.81、1.71、2.16和2.1倍。表明cFLN和CS/TPP NG可以显著增强Th1和Th17型免疫应答。小鼠体内免疫原性研究表明,分子内佐剂cFLN和纳米凝胶包封不仅可以有效增强鼻腔输送HpaA诱导的体液免疫应答,而且还可以增强小鼠胃黏膜中的黏膜免疫应答——Th1和Th17型免疫应答。因此,这些结果表明,cFLN-HpaA NG可能是有希望的经鼻输送的用于预防幽门螺杆菌感染的疫苗系统。

黏膜免疫无毒性重组肠毒素嵌合蛋白诱导的免疫应答和免疫记忆

研究证实，经胃、鼻腔、阴道或皮肤免疫以霍乱毒素（CT）为代表的黏膜免疫佐剂可诱导机体产生对抗原的黏膜和系统免疫应答。美国布法罗大学Gockel等以变异链球菌表面蛋白AgⅠ／Ⅱ的唾液结合区（SBR）为抗原，以CT及其亚单位（CTB和CTA2／B）为佐剂，通过基因嵌合（构建无毒性的SBR—CTA2／B嵌合蛋白）、