幽门螺杆菌AlpA基因中四种黏附素基因保守区的克隆、表达、纯化及鉴定

幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因 ,与胃腺癌、胃黏膜相关淋巴样组织 (MALT)淋巴瘤的发生亦密切相关 .鉴于Hp已证实的四种粘附素保守区 (AB)是外膜蛋白 (OMP)和膜孔素 (porin)样成分 ,而外膜蛋白和膜孔素样成分是优秀的疫苗候选抗原 .用PCR技术扩增AB基因 ,将其定向插入 pET 2 2b (+)载体 ,在BL2 1(DE3)大肠杆菌中表达 .测序显示AB基因长 5 88bp ,编码 195个氨基酸 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶扫描分析 ,AB基因表达的蛋白质分子质量约为 2 2 5ku ,其重组蛋白质表达量占菌体总蛋白质的 2 9% ,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达 96 % .经免疫印迹证实该重组蛋白可以被AlpA免疫兔血清所识别 .

嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达

利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.

猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌保护性免疫机制,试验筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3-8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素（AT-Adhensin）基因,根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该黏附素蛋白。结果表明,该蛋白与猪传染性胸膜肺炎康复期血清发生反应。

支气管败血波氏杆菌黏附素基因的表达及抗原性分析

为了在大肠杆菌中表达支气管败血波氏杆菌prn基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR方法以败血波氏杆菌的基因组DNA为模板扩增prn基因,插入到pMD18-T克隆载体进行测序,并将目的基因插入原核表达载体pPro-HTa中,构建重组质粒pPro-HTa-prn,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因,并用SDS-PAGE和Western-blot检测该蛋白。结果表明:成功构建了重组质粒pPro-HTa-prn,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了prn基因;重组蛋白纯化前后均可与支气管败血波氏杆菌阳性血清发生特异性反应。说明支气管败血波氏杆菌prn基因获得成功表达,重组蛋白具有与天然蛋白一样的抗原特异性。

儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达研究

目的探讨儿童尿路感染大肠埃希菌耐药性特点及黏附素基因表达。方法选择2019年10月1日-2022年10月1日首都医科大学附属北京儿童医院保定医院尿液样本分离的非重复感染大肠埃希菌160株,并进行药敏试验。根据药敏试验结果分为敏感组(n=80)和耐药组(n=80)。PCR检测fimH、fimA、fimB、papA、papB、papC、papGII基因,实时荧光定量PCR方法检测相对表达量,酵母细胞黏附试验和红细胞凝集试验检测I型菌毛及P型菌毛的黏附能力。结果敏感组对氨苄西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、左氧氟沙星的耐药率>10%,对环丙沙星、头孢唑林、妥布霉素和氨曲南的耐药率<10%,对其他抗生素则完全敏感;耐药组对头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南耐药率≤4%,对其他抗生素的耐药率均>50%。耐药组P型菌毛papGII基因检出率(40.00%)显著高于敏感组(15.00%),差异有统计学意义(χ^(2)=12.541,P<0.05);两组papA、papB和papC基因检出率差异均无统计学意义(P均>0.05)。敏感组fimH、fimB、papB、papC和papGII基因表达量高于耐药组,差异均有统计学意义(t=20.575、33.727、3.095、19.461、4.275,P均<0.05);两组fimA、papA基因表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。敏感组菌株I型菌毛的黏附率高于耐药组,差异有统计学意义(χ^(2)=13.231,P<0.05)。结论耐药组I型菌毛的黏附能力下降与菌株的适应性代价有关,fim及pap基因簇编码的其他基因的转录和缺失可能对Ⅰ型菌毛及P型菌毛的黏附功能产生影响。

医源性表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子在聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成中的作用研究

目的表皮葡萄球菌胞间黏附素基因(intercellar adhesion,ica)是细菌聚集的关键因子,通过分析医源性表皮葡萄球菌生物膜基因型,探讨ica操纵子在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面细菌生物膜形成中的作用。方法取56株医源性表皮葡萄球菌临床分离株,应用PCR法、基因测序技术检测细菌生物膜形成相关基因,包括16S rRNA、自溶素(autolysin,atlE)、纤维蛋白原结合蛋白(fi brinogen binding protein,fbe)以及ica。取医源性表皮葡萄球菌制备浓度为1×105cfu/mL的细菌悬液,并根据目的基因检测结果,分别以icaADB、atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阳性组)以及icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阴性组)与PVC材料培养。于6、12、18、24、30h各取2个PVC材料,进行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察,测量单位视野细菌群落数量及形成的细菌生物膜厚度。结果目的基因检测示,医源性表皮葡萄球菌16S rRNA阳性率为100%(56/56);icaADB、atlE、fbe阳性基因型菌株占57.1%(32/56);icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型菌株占37.5%(21/56)。测序结果示,目的基因16S rRNA、atlE、fbe、icaADB扩增产物序列分别与GenBank中基因序列相符。随时间延长,ica操纵子阴性组的PVC材料表面无明显细菌生物膜形成;ica操纵子阳性组的PVC材料表面细菌群落数量逐渐增多,细菌生物膜体积逐渐增大,24h时可见成熟的细菌生物膜结构,30h时细菌生物膜体积趋于稳定。培养各时间点ica操纵子阳性组PVC材料表面单位视野细菌群落数量(F=435.987,P=0.000)及细菌生物膜厚度(F=6714.395,P=0.000)明显高于ica操纵子阴性组,差异均有统计学意义。结论医源性表皮葡萄球菌可以分为ica操纵子阴性和ica操纵子阳性两类细菌;ica操纵子可以增加PVC材料表面细菌生物膜的形成能力、细菌群落数量及细菌生物膜厚度,在PVC材料表面细菌生物膜形成中具有重要作用。

表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子对细菌与真菌混合生物膜相关炎症作用影响的体内研究

目的探讨表皮葡萄球菌胞间黏附素基因(intercellular adhesion,ica)操纵子对气管导管材料表面表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合生物膜相关炎症作用影响的体内研究。方法取表皮葡萄球菌标准株RP62A(ica操纵子阳性,阳性组)、ATCC12228(ica操纵子阴性,阴性组)制备浓度为1×10^(6)CFU/mL的菌液,分别与相同浓度的白假丝酵母菌标准株ATCC10231菌液按照1∶1比例制备成混合培养菌液后,与气管导管材料片孵育24 h,扫描电镜观察材料表面混合生物膜形成情况。取4~6月龄新西兰兔30只分为两组(n=15),分别于气管旁植入孵育24 h的阳性组及阴性组气管导管材料。于术前及术后1、3、7 d测量两组兔体质量。术后1、3、7 d,采用ELISA检测试剂盒检测血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(monocytechemotactic protein 1,MCP-1)水平;术后7 d,扫描电镜观察取出的气管导管材料片表面混合生物膜形成情况,HE染色观察材料周围组织炎症浸润情况,平板菌落计数法观察心脏、肺、肝脏、肾脏细菌感染情况。结果扫描电镜观察示体外孵育24 h后阳性组可见明显混合生物膜结构,阴性组未见混合生物膜形成。体内实验显示两组术前及术后1、3、7 d体质量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与阴性组相比,阳性组术后1 d IL-1β及MCP-1水平,术后3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α水平均升高,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察示阳性组可见大量表皮葡萄球菌残留以及混合生物膜结构,阴性组见极少量表皮葡萄球菌残留,未见混合生物膜结构。HE染色示两组材料周围组织均可见炎症细胞浸润,其中阳性组中性粒细胞及淋巴细胞浸润较阴性组严重。两组心脏、肝脏细菌感染数量差异无统计学意义(P>0.05),阳性组肺、肾脏细菌感染数量高于阴性组(P<0.05)。结论 ica操纵子在表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合感染中可能由于增强了混合生物膜结构及其在体内的传播,导致炎症因子升高,细菌难以清除,感染迁延不愈。

产肠毒素大肠杆菌黏附素基因多重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能同时快速、灵敏、准确检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的多重PCR检测方法,根据GenBank中ETEC K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)、F41和etp A黏附素基因的保守序列设计并合成了5对特异性引物,通过多重PCR反应条件优化,建立了一种能快速检测5种黏附素基因的多重PCR方法。结果表明,该方法可同时特异性扩增出大肠杆菌K88、K99、987P、F41和etp A基因片段,对鼠伤寒沙门菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、猪巴氏杆菌、猪霍乱沙门菌、单增李斯特菌均无特异性扩增。敏感性试验结果显示,用该多重PCR能检测到K88、K99、etp A、F41和987P基因的最小活菌数分别为1.1×10^(6)、1.2×10^(6)、6.3×10^(5)、1.2×10^(5)和6.2×10~4CFU/m L。K88、K99、987P、etp A和F41的基因组DNA的检测下限分别为1.17×10^(-3)、0.1、1.88×10^(-3)、2.55×10^(-3)和1.0×10^(-5)ng/μL,表明其敏感性较高。人工模拟污染粪便样品试验结果表明,人工污染粪便样品中K88、K99、F41、987P和etpA的检测限分别为2.5×10^(8)、2.5×10^(8)、2.5×10^(3)、1.9×10^(7)和1.75×10^(3)CFU/g,进一步验证了非预增菌下该多重PCR方法的临床可行性。并利用所建立的多重PCR方法对80株大肠杆菌临床分离株进行检测,K88的阳性率为12.5%(10/80),K99的阳性率为1.25%(1/80)。研究表明:建立的产肠毒素大肠杆菌黏附素基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性,可用于临床上大肠杆菌分离菌株黏附素基因的快速鉴定。

环江香猪黏附素13基因多态性及其与仔猪腹泻的相关性分析

试验旨在对环江香猪仔猪腹泻抗性/易感的黏附素13基因(MUC13)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)/单倍型与仔猪腹泻的相关性进行分析。试验采用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术对93头环江香猪腹泻仔猪和95头健康对照仔猪进行基因分型,结合DNA测序对HRM检测结果进行验证,并通过SHEsis在线平台确定其单倍型。结果显示,环江香猪MUC13基因的G224A位等位基因分布频率在腹泻组和对照组间差异显著(P<0.05),GG、GA和GG+GA基因型分别与AA基因型相比差异均显著(P<0.05)。A112G、T170C和G164C位点各基因型频率和等位基因频率在腹泻组和对照组之间差异均不显著(P>0.05),腹泻组与对照组E位点均为野生纯合基因型。单倍型Ⅹ(GTAC)在腹泻组的分布极显著高于对照组(P<0.01)。因此,MUC13基因G224A位点和单倍型Ⅹ(GTAC)与环江香猪仔猪断奶前腹泻相关。

维氏气单胞菌TH0426株主要黏附素基因的克隆、生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)主要黏附素Aha1基因的生物信息学特性,本试验克隆了A.veronii TH0426主要黏附素Aha1基因片段,构建了Aha1基因序列进化树,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构,并进行了Aha1蛋白的原核表达及免疫原性的检测。结果显示:Aha1基因全长1 038bp,编码345个氨基酸。TH0426株Aha1与A.veronii属同一分支,具有信号肽,跨膜区,二级结构以β折叠、无规则卷曲为主。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,Aha1蛋白在大肠杆菌中成功表达且其能被鼠抗黏附素阳性血清识别,表明Aha1蛋白具有一定的反应原性。以上结果为进一步研究Aha1蛋白的结构功能Aha1基因工程亚单位疫苗的制备奠定了基础。

猪源大肠杆菌黏附素相关基因检测和耐药性分析

为了解扬州及周边地区猪源大肠杆菌的黏附素相关基因携带情况及其耐药性,本试验采集扬州大学动物医院就诊的病死猪的肝和脾等组织,进行细菌学分离鉴定;用PCR法检测分析猪源大肠杆菌分离株常见的8种黏附素相关基因:fimH、papA、papC、papG alleleⅠ、papG alleleⅢ、focA、focG和sfaS;并用药敏试验检测分离菌株的耐药性。结果显示,从送检样品中分离出25株大肠杆菌,25株分离菌中有40%的菌株携带fimH,8%的菌株携带papC,4%的菌株携带focG,其余基因未检测出;分离菌株对多西环素、卡那霉素、复方新诺明和氟苯尼考等耐药,对丁胺卡那敏感。由于黏附素相关基因fimH、papC和focG的存在,扬州及周边地区分离出的部分猪源大肠杆菌株具有尿路感染的潜力。

副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定,本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒。通过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致。经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性。提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发。

草鱼源致病性维氏气单胞菌的鉴定及其黏附特性分析

采用表型鉴定与细菌16S rRNA基因序列分析对从患病草鱼体内分离的病原菌株16-1进行分类鉴定,综合该菌株的表型特征与16S rRNA基因序列,确定其为维氏气单胞菌。随后,对该菌株的细胞黏附特性及其携带的黏附素基因进行检测与分析。结果显示,分离菌株能以聚集性方式黏附于鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)周围,平均黏附菌数随共孵育时间延长而增加,90min达到峰值,说明该分离株具有良好的细胞黏附性。黏附因子检测表明,该菌株同时携带omp AI、omp AII和ahl13种黏附素基因,这些黏附素基因在分离菌株与不同来源参考株之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别介于95.8%~99.5%和95.0%~100%(omp AI),96.3%~99.1%和97.9%~100.0%(omp AII),78.6%~99.6%和75.5%~99.4%(aha1),说明所携带的omp AI和omp AII黏附素基因在不同来源的维氏气单胞菌之间具有较高的保守性。

一例鸽大肠杆菌病的病原鉴定及其致病性研究

为了确定某赛鸽公棚病死赛鸽的病原菌,试验从送检病死鸽的肝脏分离出病原菌,然后对病原菌进行纯化培养、染色、生化试验、血清型鉴定、菌毛基因PCR检测与系统发育分析,以及肠毒素基因PCR检测、动物致病性试验。结果表明:共分离得到7株病原菌,7株病原菌均符合大肠杆菌的生物学特性;血清型分别为O55(3/7)、O1(1/7)、O164(1/7),2株未定型;分离菌除O164外,其余6株均表达黏附素基因K99、肠毒素基因STa及LT毒力因子; O55分离株对试验鸽有一定的致病性。说明该公棚赛鸽病死系由大肠杆菌引起。

表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用研究

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因——胞间黏附素A(intercellular adhesion A,ica A)基因、纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein,fbe)基因、聚集相关蛋白(accumulation-associated protein,aap)基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用。方法实验分为3组,用表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(表葡组)及白假丝酵母菌标准株ATCC10231(白念组)分别培养及混合培养(混合组),建立表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌及二者混合生长的体外生物膜模型。于培养2、4、6、8、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力,二甲氧唑黄[(2,3 bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)5〔(phenylamino)Carbonyl〕2H-tetrazolium hydroxide assay,XTT]比色法评价生物膜体外生长动力学;24、72 h扫描电镜观察生物膜超微结构。荧光定量PCR分析培养72 h表葡组及混合组ica A、fbe、aap基因表达情况。结果结晶紫染色法生物膜半定量检测示,混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚,72 h混合组超过表葡组,组间比较除72 h外,其余各时间点两组比较差异均有统计学意义(P<0.05);白念组12 h出现生物膜的生长,在整个培养周期白念组生物膜厚度均低于混合组(P<0.05)。XTT比色法生长动力学检测示,混合组整体生长速度快于白念组,且48 h后超过表葡组;混合组与表葡组除12 h差异有统计学意义(P<0.05)外,其余各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05);混合组培养2、4 h时A值低于白念组,但比较差异无统计学意义(P>0.05);6 h后各时间点A值均显著高于白念组(P<0.05)。扫描电镜观察示,随培养时间延长各组均形成结构复杂、成熟的生物膜。培养72 h荧光定量PCR检测示,与表葡组相比,混合组fbe、ica A、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成比单一微生物结构更复杂的混合生物膜;混合生物膜较单一微生物生物膜更厚,可能与表皮葡萄球菌ica A、aap、fbe基因表达增加有关。

浙江省猪源产肠毒素大肠杆菌分子流行病学调查

本研究旨在调查浙江省猪源产肠毒素性大肠杆菌的流行情况和毒力基因特征。采用标准细菌学方法对大肠杆菌进行分离,并用聚合酶链反应(PCR)方法检测大肠杆菌的毒力基因。2014-2021年共分离到137个携带ETEC黏附素或肠毒素基因的大肠杆菌菌株,其中禁抗后平均每年分离到的菌株数量是禁抗前的2倍。肠毒素基因检测结果表明,STb(129/137,94.2%)最常见,其次是STa(64/137,46.7%)和LT(62/137,45.3%);黏附素基因以F18(56/137,40.9%)最占优势,其次为K88(28/137,20.4%),未检测到K99和987P及F41等黏附素。上述137个临床分离株中共检测到16种不同的毒力因子模式,平均每8.6个菌株产生一种不同的毒力因子模式;其中39.4%的菌株仅携带肠毒素基因,检测不到经典的黏附素基因,而1.5%的菌株则与之相反。共有81株菌同时检测到肠毒素和黏附素基因,占检出总数的59.1%。在所有被检测的生长阶段,肠毒素STb均为检出率最高的肠毒素,且随着日龄增加检出率逐渐降低。黏附素F18随着仔猪日龄的增加检出率不断提高;K88黏附素在各个生长阶段均能检出,尤其在产房仔猪中检出率最高。口腔灌服不同毒力因子模式ETEC菌株对小鼠的致死率介于0~40%,攻毒7 d后不同组的小鼠肠内容物中攻毒菌株的带菌率介于0~100%。综上所述,饲料禁抗后浙江省腹泻猪群中ETEC分离率明显上升,所携带的肠毒素以STb为主,黏附素以F18为主。菌株的毒力因子模式复杂,对小鼠的致病力及在小鼠体内的持续存活能力有明显差异,说明小鼠作为猪源ETEC的传播媒介作用在不同菌株间存在较大差异。