基于鸡毒支原体黏附素蛋白的表位疫苗制备及免疫效果评价

旨在使用鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的黏附蛋白设计一种更安全、有效的多表位候选疫苗。本研究运用生物信息学方法对鸡毒支原体的多个黏附素蛋白(CrmA、GapA、Mgc2、PvpA)的B、T细胞表位进行预测。将筛选的抗原表位合成新的表位基因肽段(命名为mEA)。通过生物学在线软件分析了mEA的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构。构建重组质粒pET32a-MG-mEA,经限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化。Western blot验证重组蛋白与鸡MG阴性/阳性血清的反应性。纯化的MG-mEA重组蛋白与佐剂1∶1混匀,制备为多表位疫苗,通过SPF鸡免疫试验分析融合蛋白免疫原性。结果显示,mEA序列二级结构较稳定,抗原性良好。重组质粒经PCR扩增获得1680 bp大小的目的条带,与预计相符。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约48 ku,主要以可溶性形式存在。Western blot试验证明该蛋白反应原性良好。多表位疫苗免疫SPF鸡,经ELISA检测显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,3个重组蛋白免疫组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。攻菌结果表明,MG感染明显损伤了气管黏膜结构,而重组蛋白+佐剂制备的疫苗能够有效保护MG的损伤。综上,本研究结果为研制安全有效的候选MG疫苗提供了新的途径。

无细胞百日咳疫苗时代百日咳杆菌黏附素蛋白缺失株的研究进展

无细胞百日咳疫苗接种后的免疫持久性下降和百日咳杆菌变异是导致“百日咳再现”的两个重要原因。百日咳杆菌变异株不表达无细胞百日咳疫苗中所包含的抗原成分,其中以黏附素蛋白的缺失最为常见。大量研究表明黏附素蛋白的缺失对百日咳杆菌的侵袭力和致病性并无明显影响,被认为可以由其他毒力因子代偿。黏附素蛋白缺失株产生的原因,包括IS481序列插入等菌株自身变异相关的分子机制,以及无细胞百日咳疫苗接种后的免疫环境造成的选择性压力。我国目前处在无细胞百日咳疫苗接种初期,尚未报道发现黏附素蛋白缺失株。

牛支原体黏附素及黏附素结合蛋白研究进展

牛支原体(M.bovis)是感染牛的一种重要病原体,可导致感染牛出现肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎和生殖道炎等多种临床症状,给养牛业造成了巨大经济损失。M.bovis黏附素在M.bovis致病过程中发挥重要作用,包括病原感染、细胞入侵、免疫逃逸和毒力产生。迄今为止,已鉴定出十多种M.bovis黏附素。这些黏附素主要结合宿主细胞的纤溶酶原(plasminogen,Plg)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、硫酸肝素(heparin sulfate,HS)和淀粉样前体样蛋白-2(amyloid precursor-like protein-2,APLP2)。本文将对目前已知的M.bovis黏附素及其宿主细胞靶蛋白的研究现状进行综述,为M.bovis已知和未知黏附素的鉴定和应用提供参考。

幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用

目的表达和纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素HpaA蛋白,研究其免疫活性和对小鼠的免疫保护作用。方法诱导TB1(pMAL-c2X-hpaA)表达H.pylori黏附素HpaA蛋白,Amyloss树脂预装柱进行分离、纯化,Western blot鉴定其免疫学活性;纯化蛋白免疫小鼠后,H.pylori国际标准菌株NCTC11637攻击感染,观察H.pylori定植情况及免疫保护效果。结果获得了高纯度且免疫活性良好的目的蛋白;HpaA蛋白免疫小鼠的保护率为53.33%(8/15),与对照组统计学差异显著(P=0.002)。结论纯化HpaA蛋白对小鼠有免疫保护作用,可作为H.pylori基因工程疫苗的候选组分。

密封蛋白-4和血管上皮钙黏素在前列腺癌中的表达及相关性

目的探讨密封蛋白-4和血管上皮钙黏素在前列腺癌中的表达及相关性。方法选取浙江省金华市人民医院泌尿外科2015年1月至2017年12月收治的82例前列腺癌患者的癌及癌旁组织作为研究对象,采用免疫组织化学染色对其进行密封蛋白-4和血管上皮钙黏素的检测。比较不同特征前列腺癌患者癌组织密封蛋白-4和血管上皮钙黏素阳性率的差异,分析密封蛋白-4和血管上皮钙黏素表达的相关性。结果前列腺癌患者癌组织密封蛋白-4、血管上皮钙黏素阳性表达率均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。不同Gleason评分、TNM分期、术前前列腺特异性抗原(PSA)及精囊浸润的前列腺癌患者密封蛋白-4阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同Gleason评分、TNM分期、术前PSA、精囊浸润及切缘状况前列腺癌患者血管上皮钙黏素阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,前列腺癌患者密封蛋白-4和血管上皮钙黏素呈正相关(r>0,P<0.05)。结论前列腺癌患者中,密封蛋白-4和血管上皮钙黏素表达增高,其异常表达值得临床关注。

幽门螺杆菌黏附素保守区蛋白的免疫原性、安全性和黏附作用的体外评价

探讨幽门螺杆菌 (Hp)保守区 (AB)蛋白的体外安全性、免疫原性和黏附作用 ,以确定AB在Hp疫苗研制中的应用价值 .ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体 ,四唑盐比色法 (MTT)测定T细胞对AB的增殖反应 ,流式细胞术检测AB致T细胞表达FasL的作用 ,二苯胺 (DPA)法测定AB致T细胞凋亡率 ,光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞黏附的影响 .ELISA法共检测了 5 5份血清 ,以快速尿素酶实验 (RUT)作为平行对照 ,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为 0 76.同时 ,低剂量AB即可刺激Hp+T细胞的增殖 .体外安全性实验表明 ,AB无明显调节T细胞表达FasL的作用以及无明显致Hp-T细胞凋亡的作用 .AB抗血清能部分阻断Hp与胃癌细胞系的黏附 ,在光镜下表现为经抗AB兔血清预处理后 ,每细胞周围黏附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少 (P <0 0 5 ) .研究表明AB是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分 ,既可以刺激体液免疫 ,又能够提高细胞免疫 。

鸡毒霉形体黏附素截短蛋白表达条件的优化

研究了培养温度、培养时间、培养基pH值以及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galacto-side,IPTG)浓度等不同条件对鸡毒霉形体黏附素截短蛋白在大肠杆菌中表达量的影响。经SDS-PAGE分析表明:诱导温度为28℃、诱导时间为9 h、培养基pH值为7.0、IPTG浓度为0.010 mmol/L时目的蛋白在细菌裂解沉淀和上清液中均最大量表达,分别达到30%和17%左右。上清液经GST.Bind Resin亲和层析分离纯化后,洗脱产物中pMGAⅣ融合蛋白纯度高达95%。Western-blot分析表明,该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别,具有较好的免疫学活性。

牛源金黄色葡萄球菌黏附素纤连结合蛋白A分泌型DNA疫苗诱导小鼠免疫效应的研究

采用PCR方法对编码金黄色葡萄球菌黏附素纤连结合蛋白A(FnbpA)的A区基因片段进行了特异性扩增,构建了真核表达载体pVAX-SFn,转染BHK-21细胞后经ELISA可检测出分泌表达的FnbpA蛋白。将真核重组表达质粒肌肉注射C57BL/6小鼠,免疫后检测小鼠血清抗体效价、淋巴细胞增殖及对试验小鼠攻毒试验。结果表明,该重组表达载体诱导细胞和体液免疫应答的强度均明显超过对照组。对小鼠的攻毒试验结果提示该重组DNA经肌肉注射途径接种可对小鼠产生免疫保护。本试验的结果对该DNA疫苗今后在实际中的应用奠定了良好的试验基础。

转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白基因克隆、表达、抗体制备及应用

目的:克隆转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,表达纯化TccP,制备其多克隆抗体并研究该抗体在EHEC O157∶H7黏附宿主细胞模型中的应用。方法:从EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组中克隆得到tccP基因,构建重组表达质粒pET28a-TccP。将此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经纯化分离后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体,并用ELISA法和Western blot法对其进行鉴定。使用兔抗TccP多克隆抗体对EHEC O57∶H7黏附宿主细胞模型中的TccP分子进行定位研究。结果:获得了TccP cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-TccP;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了相对分子质量(Mr)约37 000的目的蛋白。表达产物N端氨基酸序列测序结果与GenBank公布的基因序列推定的氨基酸序列完全一致。所制备的兔抗TccP多克隆抗体经Western blot法测定可与Mr37 000目的蛋白发生特异性结合反应;免疫荧光检测发现TccP聚集在EHEC O157∶H7黏附处细胞膜的下方。结论:成功构建了pET28a-TccP载体,获得了高纯度的重组TccP及其特异性多克隆抗体。

喉鳞状细胞癌中COX-2和E-钙黏附素的表达及其意义

目的探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)表达与喉鳞状细胞癌(LSCC)发生、发展的关系及其生物学意义。方法应用免疫组织化学方法,检测45例LSCC组织、12例喉不典型增生(AH)和10例正常喉黏膜(NLM)组织中COX-2和E-cad蛋白表达水平。结果 LSCC中COX-2表达阳性率高于喉不典型增生和正常喉黏膜组织(P<0.05),而E-cad表达阳性率低于喉不典型增生和正常喉黏膜组织(P<0.05)。在LSCC组织中COX-2和E-cad表达阳性率分别为77.8%(35/45)和62.2%(28/45)。COX-2高表达和E-cad低表达与LSCC分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。LSCC中COX-2表达与E-cad表达呈负相关(P<0.05)。结论 COX-2和E-cad表达水平可作为判断LSCC分级、淋巴结转移和预后的重要参考指标。

携肠球菌Ace抗原的铁蛋白纳米粒制备与免疫效果检测

为制备携肠球菌胶原蛋白黏附素Ace抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫效果,利用生物信息学软件预测Ace抗原表位,合成相应的基因片段,分别构建含有相应抗原表位基因与铁蛋白H亚基基因的融合表达载体,同时构建融合表达Ace蛋白和H亚基的质粒pET-32a-ace-H,分别转入大肠杆菌中进行融合表达。利用Western blot鉴定各重组融合蛋白的反应原性,并利用透射电镜观察目的蛋白表征。用重组铁蛋白纳米颗粒分别制备免疫原进行家兔接种试验,并定期检测家兔血清特异性抗体水平。结果显示,正确构建了6个Ace蛋白抗原表位基因与H亚基基因的融合表达载体pET-32a-ace1-H^pET-32a-ace6-H,其中pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H为可溶性表达载体。Western blot检测显示可溶性表达的4种融合蛋白均具有较好的反应原性。透射电镜图像显示,4种融合蛋白均形成了具有中空结构的铁蛋白纳米笼,其直径与天然铁蛋白类似;而融合蛋白Ace-H纳米笼没有中空结构,且直径比天然铁蛋白大。家兔免疫试验结果显示,6种融合蛋白均在家兔体内诱导产生了特异性抗体,而且,携带单个Ace表位的铁蛋白纳米颗粒Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H与携带多表位的Ace重组蛋白以及Ace-H纳米颗粒相比,其诱导的抗体效价和消长规律均一致,其中以铁蛋白纳米粒Ace5-H的免疫效果为最佳。本研究结果表明铁蛋白纳米颗粒能有效增强蛋白质抗原的免疫原性,有望作为候选表位疫苗佐剂得到应用。

膀胱肿瘤预后相关的分子指标的研究进展

膀胱癌是我国泌尿外科临床上最常见的肿瘤之一,分为非肌层浸润性膀胱癌及肌层浸润性膀胱癌,是一种直接威胁患者生存的疾病。膀胱肿瘤以其高复发率为主要表现,是目前困扰临床医生的一个问题,不仅增加患者的治疗费用同时也大大降低了患者的生活质量。随着医学研究的迅速发展,对于肿瘤的研究逐渐深入到分子水平,发现某些分子指标对于肿瘤的病理及临床分期有指导意义,因此对于高复发率的膀胱肿瘤进行分子指标的研究,对于指导膀胱肿瘤患者的预后及提高患者的生活质量有重要指导意义。本文将就膀胱肿瘤新的分子指标的研究进展进行综述。

粪肠球菌Ace抗原表位预测及重组表位疫苗载体构建与表达

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到pET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒pET-32a-ace1、pET-32a-ace2、pET-32a-ace3、pET-32a-ace4、pET-32a-ace5、pET-32a-ace6,并经测序验证;优化诱导条件获得原核表达的重组蛋白后,用SDS-PAGE和WesternBlot验证其相对分子质量大小和免疫原性;将重组蛋白进行纯化超滤,然后进行透射电镜成像检查。结果显示,本研究成功构建了7种原核表达载体;在IPTG诱导下获得了5种可溶性表达的融合蛋白,且均有较强的免疫原性;重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H在透射电镜下观察到了具有与天然铁蛋白类似的特殊中空结构,且其直径与天然铁蛋白纳米笼类似;而带多表位的重组蛋白Ace-H虽然也能自组装成纳米级颗粒,但没有中空核心,其直径也比天然铁蛋白略大。

食管鳞状细胞癌的PTTG1表达及与上皮间质转化的关系及临床意义

目的分析食管鳞状细胞癌(ESCC)的垂体瘤转化基因1(PTTG1 )表达及与上皮间质转化(EMT)的关系及临床意义。方法选取2015 年1 月—2017 年12 月山东枣庄矿业集团中心医院接受手术治疗的73 例经病理确诊的ESCC 患者的手术标本,取癌旁组织作为对照。采用免疫组织化学法检测组织中E-钙黏附素、波形蛋白、N-钙黏附素及PTTG1 表达,采用RNA 干扰技术下调ESCC Eca109 细胞系中PTTG1 表达,采用Western blotting 检测下调ESCC 细胞系中E-钙黏附素、波形蛋白、N-钙黏附素及PTTG1 表达,采用RT-PCR检测下调ESCC Eca109 细胞系中E-钙黏附素、波形蛋白、N-钙黏附素及PTTG1 信使RNA(mRNA)表达。结果与癌旁组织比较,癌组织的波形蛋白、N-钙黏附素及PTTG1 阳性表达高(P <0.05),E-钙黏附素阳性表达低(P <0.05)。E-钙黏附素、波形蛋白、N-钙黏附素及PTTG1 表达与ESCC 患者的浸润深度、淋巴结转移、肝转移及分期相关(P <0.05)。PTTG1 表达还与ESCC 患者的分化程度相关(P <0.05)。PTTG1 表达下调ESCC Eca109 细胞系中E-钙黏附素蛋白及E-钙黏附素mRNA 增高(P <0.05),波形蛋白、N-钙黏附素、PTTG1 蛋白及波形蛋白、N-钙黏附素、PTTG1 mRNA 均降低(P <0.05)。结论 ESCC 肿瘤组织中存在PTTG1 高表达,其表达与肿瘤的EMT 相关。

拟态弧菌OmpU蛋白在草鱼肠组织中互作蛋白的筛选鉴定

【目的】为了确定草鱼肠组织蛋白中能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白发生互作的蛋白。【方法】在前期构建重组表达质粒pET-32a-OmpU基础上,通过IPTG诱导表达及亲和层析纯化获得可溶性His-OmpU融合蛋白,经Western blot分析显示该重组融合蛋白与OmpU多克隆抗体具有良好的反应原性。以His-OmpU融合蛋白为诱饵蛋白,利用His-tag pull down试验筛选草鱼肠组织蛋白中与OmpU黏附素蛋白结合的蛋白,并经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索。【结果】共鉴定出5个体外互作蛋白,分别为α-肌动蛋白2(α-Actin 2)、细丝蛋白A(Filamin A)、α-辅肌动蛋白4(α-Actinin 4)、转胶蛋白2(又称肌动蛋白结合蛋白2,Transgelin-2)和调宁蛋白2(Calponin-2)。【结论】GO功能注释分析显示,这些互作蛋白属于细胞骨架蛋白和细胞骨架调节蛋白,在病原菌的黏附、内化和致病中起着重要作用。研究结果为后期研制黏附拮抗剂和探究拟态弧菌分子致病机理奠定了基础。

金黄色葡萄球菌CP8-ClfA-FnBPB偶联物的制备及其免疫学特性

以己二酰肼为间桥,碳二亚胺为偶联剂,将纯化的血清8型荚膜多糖和纯化的ClfA-FnBPB融合蛋白偶联制备偶联物,并在偶联的过程中确定其最佳质量比和偶联比。用制备的偶联物免疫小鼠,同时用间接ELISA法检测抗体水平,并对三免后2周的小鼠进行攻毒保护试验。结果显示,用化学方法制备的多糖-蛋白偶联物在其质量比为1∶2时可成功偶联,计算得到偶联比为1∶1.89。采用间接ELISA法检测抗体水平,二免后7d,偶联物免疫组可产生抗体,且抗体效价最高可达1∶6 400。阴性对照组和单独多糖组均没有抗体产生,而单独融合蛋白组在二免后产生了抗体反应,但抗体效价较低,最高时仅为1∶100。对小鼠进行攻毒保护的结果表明,偶联物组的攻毒保护率最高,可达80%,而阴性对照组、单独多糖组以及单独融合蛋白组的保护率分别为20%、30%和60%。

粪肠球菌ace基因缺失突变株的构建

本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。