阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因的cDNA克隆与序列分析

目的对阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因进行cDNA克隆与序列分析。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫基因组RNA。以总RNA为模板,RT-PCR扩增黏附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线形载体,构建pMD-18T-ap65-3重组质粒,并进双行酶切﹑PCR鉴定及测序分析。结果RT-PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因。经凝胶电泳﹑PCR鉴定和限制酶切鉴定,成功的构建出pMD-18T-ap65-3重组质粒。序列分析表明,黏附蛋白65-3基因开放阅读框长为1 704 bp,与GenBank上公布的黏附蛋白65-3基因序列比较,其同源性高达99.6%。结论阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因体外扩增及测序的成功,为进一步研究阴道毛滴虫的致病机理及滴虫病防治方法奠定了基础。

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒pMD-18T-ap65-3经XhoI和BamHI双酶切,1.0%凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因,定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达质粒pET32a-ap65-3。重组质粒转化大肠埃希菌JM109感受态细胞中,筛选阳性克隆,进行PCR、酶切及测序鉴定正确后,将重组质粒pET32a-ap65-3转化于大肠埃希菌BL21中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)对重组蛋白进行分析鉴定。本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础。