3种微生物及其胞壁物质体外诱导家蚕血液黑化反应的观察

分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白僵菌及其细胞壁物质脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖与家蚕血液在毛细针管中混合,体外观察外源物诱导家蚕血液黑化反应的免疫防御作用。结果表明3种微生物及其胞壁物质均能诱导家蚕血液发生黑化反应,与家蚕血液混合后的大肠杆菌数目随混合时间延长及血液黑化程度加剧而下降。说明家蚕血液黑化反应与昆虫其他的免疫应答反应相同,能被微生物以及相关分子诱导和启动,发挥免疫防御作用,并且大肠杆菌在加入昆虫黑色素合成前体——多巴和多巴胺的培养基中生长繁殖受到抑制的实验结果,也是该结论的佐证。

按蚊TEP1基因与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化反应的相关性

目的对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究。方法斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组(各300只),A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10%蔗糖水。另设正常对照组(C组),常规蔗糖水饲养。分别于用药后第1、2、3和4天,取各组雌蚊的血淋巴(各50只),提取cDNA模板,设计引物,克隆斯氏按蚊TEP1基因,用荧光定量PCR检测TEP1基因在抗疟药硝喹诱导下的变化;同时解剖各组雌蚊(各25只),光镜观察约氏疟原虫卵囊的黑化情况,分析TEP1基因与抗疟药诱导的黑化反应的关系。结果成功克隆TEP1基因,推测其氨基酸序列含有TEP分子高度保守的硫酯序列区(GCGEQ)。荧光定量PCR检测结果显示,抗疟药硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因表达上调,于诱导后第3天,A组的TEP1基因相对表达量为2.423,是B组(1.036)的2.5倍,两者差异有统计学意义(P<0.05)。相同时点,光镜观察显示,A组蚊经硝喹诱导后的约氏疟原虫卵囊出现黑化现象,黑化率约14.0%,而B组则未发现有黑化现象。结论抗疟药物硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因上调,该基因与约氏疟原虫卵囊黑化相关。

昆虫黑化反应的分子机制研究进展

本文综述了昆虫黑化反应的意义、特性。

淡足侧沟茧蜂萼液对甜菜夜蛾幼虫血淋巴黑化反应和酚氧化酶活性的影响

为探讨寄生蜂寄生对寄主体液免疫的影响,研究了淡足侧沟茧蜂萼液调控甜菜夜蛾幼虫血淋巴黑化反应和酚氧化酶活性的效应。结果表明:甜菜夜蛾4龄幼虫血淋巴黑化率在注射萼液0.5 h后逐渐下降,在注射12 h后逐渐上升,随着注射后时间推移,萼液抑制其黑化作用减弱;在注射后24 h的观察时间内,注射萼液组黑化率始终低于注射磷酸缓冲液组,且在注射后的16 h内均达到显著水平;萼液对寄主4龄幼虫血淋巴酚氧化酶活性的抑制作用随注射后时间推移而减弱,注射萼液组酚氧化酶活性始终低于注射磷酸缓冲液组,且在注射后12 h内均达到显著水平。

辐照对桔小实蝇幼虫黑化反应与血细胞的影响

本文将黑化反应和血细胞总数(THC)计数两种检测方法用于桔小实蝇幼虫辐照处理后活性检测研究中。黑化研究结果表明:桔小实蝇幼虫经辐照,在-18℃,15 min处死后,室温条件下30 min内黑化程度不明显,但是用作对照的1龄幼虫从1.5 h开始、2龄幼虫从2 h开始、3龄幼虫从2.5 h开始虫体显著变黑,而经辐照的虫体变黑的时间比对照样至少延迟.0.5 h,且辐照剂量越大,黑化反应出现的时间越晚。表明辐照会抑制幼虫黑化,黑化反应可用于快速检测实蝇幼虫是否经过辐照。血细胞总数计数研究结果表明辐照处理的桔小实蝇幼虫血细胞总数显著减少,且同一辐照剂量下,龄期越高,血细胞总数越多。利用上述两种方法可定性判定桔小实蝇幼虫是否经过辐照处理。

淡足侧沟茧蜂寄生对草地贪夜蛾幼虫血淋巴黑化反应及酚氧化酶的影响

【目的】明确淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes寄生对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda血淋巴黑化率、酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)基因表达量和酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活性的影响,为更有效的利用淡足侧沟茧蜂防控草地贪夜蛾提供理论依据。【方法】通过室内寄生实验确定草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期;通过RT-qPCR分析草地贪夜蛾两个PPO基因(SfPPO1和SfPPO2)的时空表达谱;通过薄膜法统计草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴黑化率;采用吸光光度法测定草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴PO活性;采用RT-qPCR测定草地贪夜蛾被寄生后血淋巴SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量。【结果】草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期为3龄幼虫,SfPPO1和SfPPO2均在卵块和4龄幼虫中基因表达量较高,且主要在幼虫血淋巴中表达。草地贪夜蛾被寄生后12、24、48和72 h的血淋巴黑化率显著低于未寄生组(P<0.05),SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量和PO活性也低于未寄生组。相关关系分析表明,SfPPO1的相对基因表达量与SfPPO2的表达量呈现线性关系(R2=0.9124),PO活性与两个PPO基因相对表达量之间、黑化率与PO活性和PPO基因相对表达量之间均呈现正相关。【结论】淡足侧沟茧蜂寄生会抑制草地贪夜蛾血淋巴的黑化率,下调血淋巴中酚氧化酶原基因的表达量和PO活性,且PO活性、PPO基因相对表达量及血淋巴黑化率3个指标之中,两两之间均呈现正相关性。

96孔酶标板法检测家蝇血淋巴黑化反应的初步研究

目的 探讨用96孔酶标板法检测家蝇血淋巴黑化反应的可行性。方法 用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌单菌和大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌混合菌分别体外刺激家蝇3龄幼虫的血淋巴,通过96孔酶标板法分析菌刺引起的家蝇幼虫血淋巴酚氧化酶活性的变化,进一步探讨菌刺与家蝇黑化反应的关系。结果 相比正常对照的起始A490值,1~3号样品的起始A490值随加菌量的增多依次递增,其增幅分别为大肠埃希菌1.33~1.38倍,金黄色葡萄球菌1.30~2.40倍,藤黄微球菌2.60~3.00倍,大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌混合菌1.40~3.80倍。显然,菌刺可使家蝇血淋巴酚氧化酶活性增高,菌刺浓度越大,黑化反应越强,单菌刺激的效果依次为藤黄微球菌〉金黄色葡萄球菌〉大肠埃希菌,大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌混合菌刺激的效果要比单菌好。结论 用96孔酶标板法检测菌刺家蝇血淋巴黑化反应的变化可行。

核型多角体病毒对斜纹夜蛾酚氧化酶活性及血淋巴黑化的影响

以斜纹夜蛾核型多角体病毒（S1NPV）为免疫刺激因子，观察SlNPV对斜纹夜蛾幼虫酚氧化酶活性及其血淋巴黑化的影响。结果表明：斜纹夜蛾幼虫感毒后，其血淋巴黑化率在感毒1d后开始逐渐下降，随着感毒时间推移和幼虫日龄增大，病毒抑制其黑化作用增强；在感毒后连续5d观察时间内，感毒幼虫血淋巴黑化率始终低于健康幼虫，且在感毒4～5d后达到显著水平；感毒幼虫体内及其血淋巴酚氧化酶活性在感毒后前3d都是逐渐上升而后逐渐下降；感毒幼虫体内酚氧化酶活性在感毒后前3d高于健康幼虫，在感毒4d后开始低于健康幼虫，且在感毒2、3、5d后均达到显著水平；与健康幼虫相比，感毒幼虫血淋巴酚氧化酶活性在感毒2d后开始明显增强，但感毒5d后急剧下降。

淡足侧沟茧蜂寄生对甜菜夜蛾幼虫血淋巴黑化及血细胞数量和构成的影响

为探讨寄生蜂调控寄主的免疫反应,研究了淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes Szepligeti寄生对甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)幼虫血淋巴的影响。结果表明,寄生总体上降低了寄主血淋巴的黑化率;与未被寄生幼虫相比(对照),寄生蜂寄生引起寄主血细胞总数和颗粒血细胞数量下降,且寄生后第1~3 d和6 d达到显著水平;寄生蜂寄生后第1~3 d致使寄主浆血细胞数量下降,但第4 d开始寄主桨血细胞数量增高,且寄生后第6 d显著高于对照。寄生蜂寄生也改变了寄主浆血细胞和颗粒血细胞构成比例。本研究揭示了寄生蜂寄生引起寄主血淋巴黑化和血细胞数量及其构成的变化是寄主对寄生蜂入侵产生免疫响应的结果。

球孢白僵菌感染对家蚕血淋巴黑化及微生物蛋白酶抑制剂表达的影响

家蚕是一种具有重要经济价值的绢丝昆虫,也是一种重要的模式生物。家蚕易受到环境中各种病原物的侵染而发生疾病。通过观察家蚕感染球孢白僵菌后血淋巴黑化程度的变化、家蚕血淋巴蛋白SDS-PAGE分析和微生物蛋白酶抑制剂的胶内活性染色分析,研究球孢白僵菌感染对家蚕血淋巴黑化和微生物蛋白酶抑制剂表达的影响。结果表明,球孢白僵菌感染会激活家蚕血淋巴的黑化反应,参与对真菌的免疫应答。SDS-PAGE分析显示,接种球孢白僵菌后120h内家蚕血淋巴蛋白未发生明显的水解。胶内活性染色表明,家蚕血淋巴中存在一种白僵菌诱导型蛋白酶抑制剂SI-3,其抑制活性随着感染进程的推移而略有变化。研究结果不仅有助于阐明病原性真菌与家蚕的互作关系,发现新的抗真菌分子,而且对农林害虫防治具有一定的指导意义。

彩管生产中黑化膜发红、脱落的研究

介绍了在彩色显像管生产中,荫罩黑化反应的原理,并由此分析黑化膜发红、脱落时的对策。

彩管生产中黑化膜发红脱落的对策

本文详细介绍了彩色显像管生产中，荫罩黑化反应的原理，并由此分析黑化膜发红、脱落时的对策。

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmHP21的克隆及表达分析

丝氨酸蛋白酶参与昆虫对抗入侵病原体及保护受伤组织的黑化反应。为了探讨家蚕黑化反应过程中丝氨酸蛋白酶在酚氧化酶原前体级联体系的作用,克隆了家蚕的一个新的丝氨酸蛋白酶基因,命名为BmHP21(GenBank登录号:JF431073)。该基因由1 233个核苷酸组成,编码410个氨基酸。通过SMART网站预测蛋白结构显示BmHP21包括一个clip结构域和一个胰蛋白酶结构域。BmHP21蛋白和烟草天蛾Ms-HP21的氨基酸序列有55%的相似性,推测BmHP21在家蚕黑化反应中起着激活酚氧化酶原前体激酶(PPAE)的作用。RT-PCR检测结果表明,BmHP21在家蚕大部分组织包括脂肪体中都有表达,其mRNA转录几乎贯穿于整个家蚕的幼虫、蛹和成虫发育阶段,推测BmHP21除了参与黑化反应外,还有其它的生理功能。

果蝇先天性免疫研究进展

果蝇是生命科学与人类疾病研究的重要模式生物,虽然不具有人类高度专一的获得性免疫,但也有对病原微生物感染作出快速有效反应的先天性免疫应答系统,主要包括体液免疫,细胞免疫和黑化反应。文章结合国外最新研究,详细介绍果蝇体液免疫中控制抗菌肽合成的Toll信号通路和Imd信号通路中涉及的蛋白及其相互作用,并对果蝇细胞免疫中的吞噬、包埋功能和黑化反应作简要阐述。研究表明,果蝇的Toll和Imd信号通路分别与人类的TLR4和TNRF-1信号通路存在着惊人的相似之处,说明果蝇与人类在免疫调控通路方面可能存在着共同的进化起源。

家蚕血淋巴体外黑化观察及相关黑色素合成催化酶基因

观察不同生长期家蚕幼虫血淋巴在体外的黑化速度和对大肠杆菌生长的影响结果显示,随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快,对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强。RT-PCR实验显示,黑色素合成催化酶Bm Tan、Bm Po-1、Bm Yellow-f和Bm Ddc等的基因在家蚕5 L 3 d血淋巴中表达量高,Bm Black、Bm Yellow和Bm Pah等的基因也有明显表达。q PCR分析显示,黑化病蚕中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack,尤其Bmddc表达发生了显著上调。与对照相比,Ddc酶的抑制剂能显著抑制脂多糖对血淋巴的诱导黑化作用。用大肠杆菌注射家蚕幼虫,血淋巴中多巴和多巴胺的含量明显上升。这些表明家蚕幼虫血淋巴黑化与防御免疫有关,Bmddc很可能在幼虫血淋巴的免疫黑化中发挥作用。

无脊椎动物免疫研究新进展

在国家留学基金委员会和德国研究委员会(DFG)的资助下,笔者于2002年8月至11月在德国吉森大学动物研究所工作了3个月,主要从事昆虫免疫学方面的研究。笔者所在的川载坷(Prof.Dr.Trenczek)教授实验室在昆虫细胞免疫研究方面成绩突出,他们以烟草天蛾为材料,以单克隆抗体为工具,研究昆虫血细胞的结构、功能、发生和调控等。我们在国内主要开展家蝇和对虾体液免疫方面的研究,具体的是进行抗菌肽基因克隆、表达以及重组表达等方面的研究。

昆虫天然免疫的研究进展

对果蝇等昆虫天然免疫的研究有利于揭示人类自身的免疫机制,并为感染性疾病和自身免疫病等的治疗提供新思路。昆虫的天然免疫机制包括物理防线、体液免疫和细胞免疫等方面。在病原体入侵昆虫体内后,昆虫可通过模式识别机制识别病原体并通过Toll途径和Imd途径等机制启动昆虫的体液及细胞免疫反应。昆虫的体液免疫和细胞免疫并不是绝然独立的,而是相互联系、相互促进和协作。在昆虫的各种免疫反应中,抗菌肽的产生、黑化包被反应和细胞吞噬作用是最为重要的防御机制。

家蚕BmPGRP-S5蛋白的抑菌活性及其在细胞免疫中的作用

【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition proteins,PGRP)可以特异性识别细菌细胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan,PGN),并通过免疫缺陷(immune deficiency,IMD)途径和Toll途径诱导昆虫抗菌肽的产生。本研究旨在探讨家蚕Bombyx mori肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5的抑菌活性及在引发家蚕细胞免疫中的作用。【方法】用果蝇胚胎S2细胞表达BmPGRP-S5蛋白;通过细菌生长曲线法检测BmPGRP-S5蛋白对大肠杆菌Escherichia coli K 12 D 31、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的抑菌活性;ELISA检测BmPGRP-S5蛋白与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞壁组分的结合力;通过测定吸光值和观察家蚕血淋巴黑化反应分析BmPGRP-S5对细菌胞壁组分激活酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)的影响,并通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记法检测BmPGRP-S5对家蚕血细胞吞噬细菌的影响。【结果】获得表达纯化的BmPGRP-S5蛋白。BmPGRP-S5蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K 12 D 31和巨大芽孢杆菌无抑菌效果,加入40μmol/L的Zn 2+后,其对巨大芽孢杆菌的抑菌效果明显增强。ELISA结果表明,BmPGRP-S5蛋白与来自金黄色葡萄球菌的PGN和枯草芽孢杆菌脂磷壁酸(LTA)的结合能力较强,同时也促进了这两种细菌胞壁组分激活家蚕血淋巴酚氧化酶原,加快胞璧组分介导的家蚕血淋巴黑化反应。加入BmPGRP-S5蛋白后,家蚕血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率提高到53.33%左右,对大肠杆菌K 12 D 31的吞噬率在25.83%左右,对巨大芽孢杆菌的吞噬率达30.83%左右,与对照组相比显著增强。【结论】BmPGRP-S5抑菌作用依赖于Zn 2+,可能与其酰胺酶活性有关。BmPGRP-S5可以通过识别细菌胞壁组分PGN或LTA在家蚕的黑化反应和细胞吞噬中发挥作用。本研究使用的BmPGRP-S5蛋白是通过在果蝇S2细胞进行重组表达获得,更能真实地反映其在昆虫体内生理状态下的功能活性。因此,本研究的结果对进一步开发利用BmPGRP-S5有指导意义。

昆虫天然免疫反应研究前沿

昆虫天然免疫反应分为体液免疫和细胞免疫两种,二者共同作用抵御细菌、真菌、病毒等外源病原物的侵染。体液免疫反应主要包括黑色素形成和抗菌肽产生两种机制,细胞免疫反应包括吞噬、集结和包囊等作用类型。在昆虫天然免疫反应中,昆虫模式识别蛋白负责识别并结合外源物表面特有的模式分子,丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、各种配体、受体等负责级联信号途径的激活和调控,抗菌肽、黑色素等效应分子则负责对入侵物的杀灭和清除。本文根据国外和作者自己的研究,综述了昆虫天然免疫反应的研究进展,并针对该领域最新的研究动态展望了昆虫肠道免疫、昆虫免疫致敏以及不完全变态昆虫免疫学等这些研究前沿。