冻结方式对黑斑蛙后腿肌肉持水性及肌原纤维蛋白结构特性的影响

本研究采用-20℃冰柜冻结、-50℃冰柜冻结、-50℃液氮冻结、-80℃液氮冻结处理黑斑蛙后腿,探究不同冻结方式及冻结温度对黑斑蛙后腿肌肉持水性及肌原纤维蛋白结构的影响。结果表明:-20℃冰柜冻结、-50℃冰柜冻结、-50℃液氮冻结、-80℃液氮冻结组通过最大冰晶生成带(-1~-5℃)的时间分别为91.5、57.0、1.5、0.5 min。相比两组冰柜冻结组,两组液氮冻结组的解冻损失率降低,不易流动水含量升高,自由水含量下降;相比新鲜样品,冷冻后黑斑蛙后腿的肌原纤维持水性、蛋白溶解度、总巯基含量、内源荧光强度显著下降,蛋白粒径、表面疏水性、无规卷曲相对含量呈现升高趋势。其中-50℃液氮冻结组的肌原纤维持水性、蛋白溶解度、总巯基含量、内源荧光强度分别下降了8.10%、9.57%、10.50%、67.36%,体积平均粒径、表面疏水性、无规卷曲相对含量分别增加了100.05%、82.24%、13.65%,变化幅度显著低于其他实验组(P<0.05)。-80℃液氮冻结组黑斑蛙后腿肌原纤维蛋白变性程度显著低于-20℃冰柜冻结组,但高于-50℃液氮冻结组(P<0.05)。扫描电子显微镜观察结果显示,-50℃冰柜冻结和-50℃液氮冻结组肌纤维排列较为紧密规则,-80℃液氮冻结的黑斑蛙肌纤维排列规整但有轻微裂隙,-20℃冰柜冻结组肌纤维出现明显破裂。综上,液氮冻结可减缓黑斑蛙后腿肌肉冷冻过程中水分迁移,有效抑制黑斑蛙肌原纤维蛋白的冷冻变性,其中-50℃液氮冻结效果优于-80℃液氮冻结。

基于转录组分析温度诱导黑斑原(Glyptosternummaculatum)选择性剪接的变化

将采自多雄藏布支流(N29°27’58.72",E 86°54’36.06")的90尾雌性黑斑原(Glyptosternum maculatum)分为3组,每组30尾:A组为对照组,水温为12℃;B组以2℃/h从12℃下降到4℃;C组以2℃/h上升,达到24℃时,黑斑原濒死时开始实验,利用转录组数据分析黑斑原在温度诱导后的选择性剪接的变化。结果表明:高温组(24℃)、对照组(12℃)和低温组(4℃)处理后,黑斑原肝脏中选择性剪接事件存在互斥外显子(MXE)和外显子跳跃(SE)两种类型;高温和低温处理后选择性剪接事件和基因均明显减少,高温组和低温组分别比对照组减少了16.39%、16.35%和5.17%、6.21%;与对照相比,24℃和4℃分别有75和32个特有基因高表达。GO分析显示,在24℃时分别有190、88和318个基因富集到生物学过程、细胞定位和分子功能,而4℃分别有101、50和210个基因富集到这3个GO分类中。KEGG分析显示,83和9通路分别显著富集在24℃和4℃,其中通路内质网蛋白质加工和嘌呤代谢在高温组和低温组共有,2个通路中显著差异基因为xdh、papss2、impdh1、polr3h、dnajc1、derl2和dnajc10,其中dnajc1基因在高温组和低温组均差异显著。dnajc1基因属hsp40亚家族成员,生物信息学分析发现dnajc1基因在4℃和12℃中均为1个剪接体,高温处理后产生了2个剪接体,说明dnajc1基因在黑斑原遭遇温度诱导后肝脏通过产生选择性剪接体来保护细胞内的稳态。本研究首次研究了黑斑原应对温度反应的选择性剪接,为了解鱼类应对非生物应激的分子机制提供理论基础。

黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)皮肤RNA-Seq数据中补体样组分分析

黑斑原鮡为我国雅鲁藏布江特有鱼类,其皮肤补体系统在适应低温、急流水域特性中发挥着重要的作用。文章基于前期RNA-Seq数据检索黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)皮肤补体样组分,并对其结构域及高温应激后的基因表达水平进行了分析。结果表明:共获得79条补体样成分unigene,分别编码1个C1q结构域蛋白、1个含C1r结构域蛋白、3个纤维蛋白原相关蛋白、10个丝氨酸蛋白酶、11个含硫酯键蛋白、7个补体受体、14个补体调节因子及4个纤胶凝蛋白。结构域分析表明:黑斑原鮡补体样组分均含有相应的保守结构域,与其他鱼类补体组分的研究结果基本一致。经15℃养殖水温刺激后,79条补体样组分unigene中共有47条unigene表达上调,其中8条为模式识别受体unigene,结合其他鱼类补体组分的研究结果,推测黑斑原鮡已形成了一个含有多种补体组分的补体系统,且具有凝集素途径或替代途径行使补体的生物学功能。

黑斑原鮡仔鱼开口饵料的初步试验

该试验旨在研究不同开口饵料和组合方式对黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)仔鱼成活率和生长的影响。将(0.0206±0.004)g的仔鱼随机分成11个饵料组,放置在规格为3.6 m×0.5 m×0.2 m的孵化槽中进行为期42 d的投喂试验。每天记录死亡仔鱼数量,每7 d测量生长情况。试验结果显示,不同饵料组对黑斑原鮡仔鱼的影响存在差异。具体而言,摇蚊幼虫组的死亡率最低,其次是摇蚊幼虫+螺旋藻组,然后依次是鳗鱼饲料+螺旋藻组、鳗鱼饲料组、鳗鱼饲料+螺旋藻+摇蚊幼虫组和其他组合。在鱼体全长和鱼体质量生长方面,猪肝组的生长最慢,鳗鱼饲料+螺旋藻+摇蚊幼虫组的生长最快,其次是蚊幼虫+螺旋藻组。研究表明,黑斑原鮡仔鱼的开口饲料,选择使用摇蚊幼虫+螺旋藻或者鳗鱼饲料+螺旋藻+摇蚊幼虫的饵料组可能会有较好的效果。

黑斑原鮡对急性高温耐受性的研究

为探究黑斑原鮡(Glyptosternon maculatum)鱼苗与成鱼对急性高温胁迫的耐受情况,本研究测定了鱼苗与成鱼在不同急性高温胁迫下的半致死时间,以及成鱼的呼吸频率。结果表明:黑斑原鮡鱼苗的半致死时间(LT_(50))随水温的升高而缩短,不同水温组的半数死亡时间存在显著差异(P<0.05),其中28℃组在13.53 h可达到半数死亡,24℃则为71.20 h;在高温胁迫下,成鱼的呼吸频率显著升高,24℃组的半致死时间(LT_(50))为15.60 h,远短于鱼苗在该水温下的半致死时间。急性高温胁迫下黑斑原鮡鱼苗的耐受能力强于成鱼,但两者均容易在短期内发生大量死亡,因此在养殖过程中应时刻关注水温的变化。

雅鲁藏布江黑斑原鮡繁殖生物学研究

对2004—2006年采集于雅鲁藏布江拉萨河的190尾黑斑原鮡进行了繁殖生物学研究。雄性最小性成熟(精巢Ⅳ期)个体体长141.7mm,体重45.2g,性体指数1.09%,雌性最小性成熟(卵巢Ⅳ期)个体体长146.8mm,体重66.7g性体指数11.52%,相应年龄均为5龄。初次性成熟年龄(L50):♂,170.1mm相应年龄为7龄;♀,150.2mm,相应年龄5龄。通过组织切片法和GSI的周年变化分析,繁殖时间集中在5—6月,每年繁殖一次,繁殖之后的6—8月卵巢从Ⅵ期回复到Ⅲ期,9月卵巢发育到Ⅳ期越冬。卵径频率分布显示,卵巢发育类型为分批同步型,卵巢中至少存在2批卵径,每年成熟一批卵并同时产出,产卵类型为完全同步产卵。卵黏性,成熟卵卵径在2.04—3.37mm之间,平均(2.83±0.16)mm。对19尾产卵前夕(体长为151.0—210.0mm)的标本进行统计,其绝对繁殖力范围在525—2058粒之间,平均为(1244±346)粒,相对繁殖力为(14.7±5.8)粒/g。绝对繁殖力与体长呈直线正相关,表达式为F=13.624L-1187。

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。

黑斑原鮡个体生殖力研究

研究了西藏雅鲁藏布江中的黑斑原鮡个体生殖力及其与生物学指标的关系.结果表明,黑斑原鮡个体绝对生殖力r为141～2162粒,平均727粒;相对体长生殖力r/L为10.22～117.36粒/cm,平均43.26粒/cm;相对体重生殖力r/W为3.24～27.01粒/g,平均11.79粒/g;r、r/L与年龄、体长、纯体重、卵巢重和成熟系数显著相关,r/W与卵巢重、成熟系数显著相关;个体绝对生殖力与各指标逐步回归方程为:r=-619.8699+4.6497 Wn+96.5101 Wo+16.5507 M+2.6143ρ,经卵径分布频数图推断,黑斑原鮡为不分批产卵鱼.

不同开口饵料对黑斑原鮡仔鱼成活率和生长的影响

分别采用浮游动物、蛋黄、水丝蚓、鳗鱼饲料对黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)仔鱼进行投喂,探讨这4种开口饵料对其成活率及生长的影响。试验开始时,黑斑原鮡仔鱼全长为(10.60±0.34)mm,体重为(0.025±0.003)g,试验周期共计21 d。结果显示:鳗鱼饲料组和浮游动物组成活率最高,仔鱼的平均全长体重增长率也均高于其他两组。水丝蚓组存活率上明显低于其他组,且生长速度也最低。结果表明,4种开口饵料效果比较,推荐浮游动物和鳗鱼饲料作为黑斑原鮡仔鱼最适宜的开口饵料。

黑斑原姚特殊器官-腹腔外肝

在黑斑原鮡 Glyptosternum maculatum(Regan)(鲇形目,鮡科)体内发现一个特殊器官——腹腔外肝,即该鱼除在腹腔内具有正常肝脏外,在皮肤与体壁肌肉之间还有一与腹腔内肝脏连接的附属组织(腹腔外肝)．腹腔外肝的组织学结构与腹腔内肝脏完全一样,LDH,EST, MDH和ADH同工酶带无差异,表明这一特殊器官确为肝脏组织．深入研究黑斑原鮡腹腔外肝可为研究鮡科鱼类的系统发生和进化提供线索．

黑斑原鮡的染色体组型及NOR单倍性

鮡科鱼类属中印山区复合体,栖息于山区的湍急河流中,在我国共分布有11属20余种(亚种)。由于采集等研究中的具体困难,关于鮡科鱼类的核型报道极少,国内外共计仅5种,而NOR研究则未见报道。本文首次报道隶属于鲶形目(Siluriformes)、鮡科(Sisoridae)、原(鱼兆)(鱼兆)属(Glyptosternum McClelland)的高原鱼类—黑斑原跳(Glyptosternum maculatum)的染色体组型、硝酸银染色及GC碱基特异性荧光染料(CMA)染色研究结果。

黑斑原鮡的生物学研究进展

黑斑原鮡是我国西藏雅鲁藏布江特有物种,主要分布于日喀则、拉萨、林芝等地区。从黑斑原鮡的形态与组织特征、消化系统与食性、年龄与生长、生理生化特性、性腺发育、繁殖生物学研究和遗传学研究等方面进行了综述,并指出黑斑原鮡资源合理开发与利用中亟待解决的关键问题。

黑斑原鮡卵黄囊期仔鱼生长与发育的研究

【目的】研究黑斑原鮡早期发育,丰富其早期生物学内容。【方法】在实验室条件下对早期发育阶段(0~35 d)黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)的生长发育进行研究,对卵黄囊期仔鱼的全长(LT),体长(ST),眼径(D),体高(HB),湿重(W),卵黄囊(YC)6项指标进行显著性比较分析,同时对卵黄囊与日龄、体重、全长、体长、体高、眼径之间的关系进行回归分析。【结果】黑斑原鮡仔鱼在孵化后第18天开始摄食,第30天卵黄囊基本消失。卵黄囊与日龄之间呈对数相关,与体重之间符合三次方程,与体长和全长存在倒数函数。【结论】黑斑原鮡卵黄囊存在时间较长,为适应其复杂多变的生存环境,在早期发育阶段优先发育对生长生存起关键作用的器官,这对提高仔鱼的存活率具有重要的生态学意义,对早期仔鱼的培育具有指导意义。

黑斑原(鱼兆)脑颅骨骼形态学的研究

采用改进的透明骨骼法,研究了黑斑原(鱼兆)(Glyptosternum maculatum)的脑颅骨骼。其脑颅骨骼由28块膜骨、软骨化骨以及复性骨组成,眼区系列骨骼退化,缺少围框骨系,仅有额骨、副蝶骨、翼蝶骨,同时部分脑颅骨骼发生特化,如出现了颌须骨、基垫骨,这些骨骼在其他鱼类中未有报道。这些退化和特化现象与黑斑原(鱼兆)的生境有着密切的关系。黑斑原(鱼兆)的脑颅骨骼具有大多数底栖鱼类脑颅共有的结构:前囱和后囱。黑斑原(鱼兆)脑颅各骨骼与鱼脑接触面或为隆嵴,或为陷窝,从而最大程度地保护了鱼脑免受外界的冲击和震荡。一些骨骼存在大小不一,位置相对固定的孔眼,为出入大脑的血管及神经的通道。

黑斑原鮡AFLP分析体系的建立

建立黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)AFLP反应体系,对DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增和银染效果进行了探索。结果表明,40μLTaqI酶切体系中65℃先酶切2h,EcoRI酶切和连接同时进行,EcoRI酶和T4DNA连接酶的用量均以2U为宜,温度与时间分别为37℃和3h,连接产物稀释10倍作为预扩增的模板。利用这种优化的反应体系,5对选择性扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是:E-AAC/T-AAT、E-AAC/T-AAG、E-AAG/T-ACA、E-AAG/T-AAT和E-AAT/T-AGA。5对引物组合对96个样本扩增,共得到332条清晰可辨、可重复的条带,平均每对引物组合扩增出66.4条带,其中51条带是多态的。将AFLP技术用于黑斑原鮡的研究,通过优化体系的建立,为其种质资源的研究奠定基础。

温度对黑斑原(鱼兆)仔鱼生长的影响

将孵出30d、平均体质量0.043g的黑斑原(鱼兆)Glyptosternum maculatum仔鱼常规饲养在4个循环水养殖系统(长1.8m×宽0.6m×高0.6m)中,水温保持在9℃、12℃、15℃和18℃下,每个温度组设置3个平行,研究不同温度对黑斑原(鱼兆)仔鱼生长及存活率的影响。35d的饲养结果表明:随着温度的升高,黑斑原(鱼兆)仔鱼的生长加快,死亡率增加,其中18℃组黑斑原(鱼兆)最早开始死亡,9℃组黑斑原(鱼兆)存活率最高。在整个饲养期间,水温9℃组与12℃组黑斑原(鱼兆)全长和体质量生长最快,死亡率最低,显著高于其他组(P<0.05)。因此,9～12℃为黑斑原(鱼兆)仔稚鱼的适宜培育温度。

黑斑原肌肉营养成分与品质评价

为探究黑斑原肌肉营养成分,合理开发和保护利用黑斑原种质资源,对采自雅鲁藏布江上游流域的7尾黑斑原进行营养物质测定及氨基酸分析,分析其肌肉营养品质,并对其营养品质进行评价。结果表明,黑斑原肌肉(鲜质量)中水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量分别为77.92%、17.64%、1.42%和0.29%。黑斑原肌肉中17种氨基酸的总含量为661.6mg/g(干质量),其中必需氨基酸总含量为268.1mg/g(干质量),占氨基酸总量的40.52%,必需氨基酸的构成比例低于联合国粮农组织/世界卫生组织的标准。黑斑原的第一限制性氨基酸为缬氨酸,第二限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸,必需氨基酸指数为58.12,4种呈味氨基酸总含量为901.7mg/g(干质量)。黑斑原肌肉中重金属汞含量最高,为0.493mg/kg(鲜质量),黑斑原肌肉为砷重度污染级别。研究表明,黑斑原肌肉中,蛋白质质量较好,重金属汞富集显著,黑斑原肌肉为重金属轻度污染级别。

西藏黑斑原两个野生群体的形态差异

黑斑原(Glyptosternum maculatum)是中国唯一的原属鱼类,在中国仅分布于西藏雅鲁藏布江。为了解黑斑原两个野生群体间是否存在形态差异及差异分化的程度,对雅鲁藏布江支流尼洋河及干流日喀则拉孜江段的样本进行了形态学测量,共测量了10项常规可量性状和19项框架结构性状。结果表明,独立样本T检验显示林芝群体与日喀则群体在外部形态特征上存在差异。主成分分析结果显示日喀则群体的形态特征多样性高于林芝群体,两江段的黑斑原只根据形态特征难以完全分开;且形态差异呈现多元化现象,所测性状不足以概括两个群体间的形态差异。差异检测结果显示两个群体的表观形态差异未达到亚种的水平。环境差异及生存压力的不同可能是导致两个群体形态差异分化的主要原因,而之前群体间广泛的基因交流可能抑制了这种分化。

黑斑原肌肉脂肪酸及无机盐组成特征分析

为探究黑斑原肌肉营养成分,合理开发和保护利用黑斑原种质资源,分析采自西藏自治区日喀则市昂仁县境内(N 29°27′58.72″,E 86°54′36.06″)体质量为(158.92±24.10) g的黑斑原肌肉脂肪酸和无机盐组成成分。试验结果显示,黑斑原肌肉(鲜样)中含有16种脂肪酸,其中总饱和脂肪酸8种,总量为1015.7 mg/kg,单不饱和脂肪酸2种,总量为494.4 mg/kg,多不饱和脂肪酸6种,总量为1148.3 mg/kg,必需脂肪酸含量为108.37 mg/kg,二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量为960.08 mg/kg。黑斑原肌肉的致动脉粥样硬化指数和血栓形成指数分别为0.40和1.18。黑斑原肌肉中共检出无机盐元素19种,其中K含量最高,为4061.23 mg/kg,V含量最低,为0.01 mg/kg,其中Ca∶P为1∶164,Na∶K为0.33∶1。对黑斑原肌肉中部分无机盐元素进行了风险评估,Zn元素风险指数最大,最大风险指数为16.13%~39.53%,Se元素的风险指数最小,最大风险指数为0.02%~0.03%,所评估的几种无机盐元素风险指数均在安全范围之内。综上,黑斑原肌肉中多不饱和脂肪酸含量丰富,无机盐元素含量丰富,具有较高的食用和保健价值。

黑斑原鮡皮肤组织结构及其COL1A1基因的克隆与分析

采用组织学与分子生物学方法开展了黑斑原鮡皮肤组织结构和Ⅰ型胶原蛋白基因的表达特征研究。结果表明:(1)黑斑原鮡的皮肤裸露无鳞,均由表皮和真皮组成。黑斑原鮡表皮层由复层上皮细胞和黏液细胞以及基底细胞组成。其表皮层的厚度显著大于真皮层厚度,且不同部位表皮层的厚度各不同,但各部位真皮层的厚度接近。其中,腹部表皮层的厚度最厚,为(102.36±3.43)μm;头部最薄,为(66.91±9.73)μm。(2)黑斑原鮡头部、背部色素细胞含量丰富,腹部色素细胞含量较少。(3)黑斑原鮡Ⅰ型胶原蛋白的α1基因(COL1A1)的cDNA全长序列为6683 bp,其开放阅读框为4350 bp,编码1449个氨基酸。(4)BLAST同源性分析结果显示,黑斑原鮡COL1A1基因的氨基酸序列与巨魾的同源性最高,为92.06%,呈现出较高的保守性。(5)系统进化树分析表明,该基因与巨魾处于同一支,亲缘性最近。(6)生物信息学分析显示,黑斑原鮡COL1A1蛋白质的相对分子质量为137.14 KDa,理论等电点是5.42,为α螺旋β折叠三重螺旋结构蛋白,含有1个COLFI结构域、1个VWC结构域、1个RPT1结构域、2个RPT3结构域和8个Pfam Collagen结构域。