导水管周围灰质内注射黑皮质素受体4型拮抗剂HS014抑制乳腺癌骨转移模型大鼠骨癌痛

目的 观察导水管周围灰质内注射黑皮质素受体4型（MC4R）拮抗剂对骨癌痛模型大鼠疼痛行为学及腰段脊髓星形胶质细胞活化的影响,探讨其治疗骨癌痛的机制.方法 选择雌性SD大鼠18只,随机分为3组（n=6）：A组（对照组）：左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl生理盐水（NS）;B组（模型组）：左侧胫骨上段骨髓腔注入3μl MRMT-1大鼠乳腺癌细胞（1×10^3/μl）,导水管周围灰质（PAG）内注射NS 0.5μl;C组（HS014组）：造模同B组,PAG内注射MC4R拮抗剂HS0140.5μl.术后每24 h在PAG内注射HS014（0.5 μg/0.5μl）或NS 1次,连续注射至术后13 d.大鼠与术前及术后1、3、7、14 d给药后60 min内,采用热板测痛仪测试大鼠的热痛阈值.第14天取大鼠脊髓L4～L6节段,采用免疫组织化学方法观察骨癌痛大鼠腰段脊髓星形胶质细胞阳性产物分布及变化.结果 A组大鼠对热痛阈值在术后各时间点组内比较差异无统计学意义（P＞0.05）;B、C组大鼠对热痛阈值在术后的前6d与A组比较升高（P＜0.05）;术后7～14d,与B组大鼠对热痛阈值比较,C组明显降低（P＜0.05）.大鼠腰脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应吸光度值C组（50.15 ±1.98）比B组（59.46 ±2.55）降低（P＜0.05）.结论 导水管周围灰质内注射MC4R拮抗剂HS014抑制乳腺癌骨转移模型大鼠骨癌痛,其机制可能是抑制脊髓星形胶质细胞激活.

选择性激动黑皮质素4型受体(MC4R)通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号途径对抗大鼠脓毒症致急性肝损伤

目的观察选择性激动黑皮质素4型受体(MC4R)对脓毒症致急性肝损伤大鼠的影响。方法 64只雄性SD大鼠随机分假手术组(假手术后用PBS处理)、盲肠结扎穿孔(CLP)组(采用CLP建立脓毒症模型)、Ro27-3225处理组(CLP后用Ro27-3225处理)和Ro27-3225假手术对照组(假手术后用Ro27-3225处理),每组16只(10只大鼠观察术后一般状态和72 h生存率,另外6只大鼠于术后24 h采集血液及肝组织标本)。各组分别于术后30 min腹腔注射PBS或Ro27-3225(180μg/kg),术后24 h测定大鼠心率(HR)及平均动脉压(MAP)、大鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。动物处死后,HE染色观察肝组织病变,反转录PCR检测肝组织中Toll样受体4(TLR4)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和caspase-3 mRNA水平,免疫组织化学染色检测肝细胞中核因子κB(NF-κB)p65的表达,并分析NF-κB p65核阳性率。结果与假手术组相比,CLP组大鼠72 h生存率和MAP降低,血清中AST和ALT水平明显升高,肝索排列紊乱,肝细胞水肿,有明显炎性细胞浸润,肝组织中TLR4、HMGB1和caspase-3 mRNA水平明显升高,肝细胞中NF-κB p65核阳性率明显升高。与CLP组相比,Ro27-3225处理组大鼠72 h生存率和MAP明显升高,血清中AST和ALT水平明显降低,肝组织结构损伤明显减轻,肝组织中TLR4、HMGB1和caspase-3 mRNA水平降低,肝细胞中NF-κB p65核阳性率明显降低。结论脓毒症能引起肝损伤,选择性激动MC4R可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号途径,减轻炎症反应,降低脓毒症引起的肝损伤。

激动黑皮质素4型受体对抗脓毒症诱导的肾脏损伤

目的:观察激动黑皮质素4型受体(MC4R)对抗脓毒症诱导的肾脏损伤作用,并探讨其机制。方法:雄性SD大鼠24只,随机分为:假手术组(Sham)、Sham+MC4R激动剂Ro27-3225组、盲肠结扎穿孔组(CLP)和CLP+Ro27-3225组,造模24h后测定血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平,HE染色观察肾脏形态学变化,免疫组化观察肾小管细胞NF-κB P65的表达,RT-PCR测定肾脏组织NF-κB mRNA表达情况。结果:与Sham组相比,CLP组血清BUN和CRE水平明显升高(P<0.01),组织切片显示CLP组大鼠肾小体中血管球淤血、皱缩、肾小囊腔扩大,伴肾小管上皮细胞肿胀和坏死。肾脏组织NF-κB P65表达呈强阳性,NF-κB mRNA表达增高(P<0.01)。与CLP组相比,CLP+Ro27-3225组BUN和CRE水平下降(P<0.01),肾小体、肾小管损伤减轻,肾脏组织NF-κB P65表达和NF-κB mRNA表达下降(P<0.01)。结论:脓毒症大鼠肾脏功能受损,激动MC4R可对抗脓毒症诱导的肾脏损伤,这可能与减少NF-κB的表达,降低炎症反应有关。

Western blot鉴定背肩胛棕色脂肪黑皮质素4型受体的研究

旨在探究Western blot检测低丰度蛋白表达及试验过程对检测结果的影响。本试验以6~8周龄C57/BL6小鼠背肩甲棕色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT)为试验材料,以低丰度表达的黑皮质素4型受体(Melanocortin-4-receptor,MC4R)为检测蛋白,不同蛋白处理方法及电转膜液的组分、pH为试验对照条件,探究蛋白提取方法、电转液的组分与pH对转膜效率的影响。结果显示,转膜初始电压及功率与转膜液中十二烷基磺酸钠(SDS)含量及pH极显著相关,恒流转膜时,转膜液中SDS含量与转膜电压及功率呈反比,pH为8.0时的转膜电压及功率极显著高于pH 7.6(P<0.01)和8.6的转膜电压及功率(P<0.001);MC4R及相关蛋白在醇类物混合裂解液(20%Methanol+1%Triton+1%SDS+RIPA)的蛋白处理组的表达显著优于单独RIPA的蛋白处理组(P<0.05),极显著优于Trizol的蛋白处理组(P<0.01)。综上,于MC4R蛋白而言,在裂解液的基础上添加增强剂(Triton和SDS),可促进蛋白提取的效率,提高抗体检测的灵敏性。上述结果有助于相关操作人员对主要细节的认识,提高试验的灵敏及重复性。

黑皮质素受体-4在癫痫模型大鼠脑组织中的表达及相关机制

目的探讨黑皮质素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)在癫痫模型大鼠脑组织中的表达及可能的相关机制。方法将52只雄性SD大鼠分为对照组,6、24、72 h、7、14、30、60 d 8个实验组,实验组建立氯化锂-匹罗卡品模型,采用Western blot、免疫组织化学、免疫组织荧光法检测MC4R在模型大鼠脑组织中的表达及分布。另外40只雄性SD大鼠,分成正常对照组、戊四氮组(pentylenetetrazol,PTZ)、PTZ+0.9%Na Cl组和PTZ+HS014组(HS014为MC4R特异性抑制剂),建立PTZ慢性点燃模型,记录各组发作情况。建模28 d后将各组大鼠处死,Western blot检测各组大鼠PhspoGluR1(Ser 845)的表达情况。结果与对照组相比,MC4R在氯化锂-匹罗卡品模型大鼠脑组织中呈动态升高趋势,并于第14天达峰值(P<0.01)。在PTZ慢性点燃过程中,与对照相比,经HS014干预大鼠的平均发作评分明显降低(P<0.05),全身强直阵挛发作(generalized tonic-clonicseizure,GTCS)的潜伏期明显延长(P<0.05)。29 d后Western blot检测结果显示HS014处理组大鼠脑组织中的Phspo-GluR1(ser845)表达量较PTZ组明显下降(P<0.05)。结论 MCR4可能通过调节GluR1的ser 845位点的磷酸化水平参与到了癫痫的发生、发展中。

猪黑素皮质素受体4基因的单倍型检测与分析

黑素皮质素受体4(melanocortin 4receptor,MC4R)是G蛋白耦联受体超家族的一个成员,在人和许多动物的体重、能量稳态和采食量的调控中发挥重要作用。现采用直接克隆测序的方法对23头长白猪、25头大白猪、19头民猪和7头野猪的MC4R基因进行了测序与分型。共检测到SNP位点72个,其中发生频率在2次以上的SNP位点有6个,有3个为错义突变,引起了多肽链氨基酸的替代;6个SNP位点共组成了14种单倍型,其中H1、H3、H5、H6、H7、H9、H11和H14为首次发现的单倍型。

新型黑皮质素4受体激动剂减肥作用研究

目的筛选具有黑皮质素4受体(MC4R)高亲和活性的α-MSH类似化合物,分析其激动活性,并观察其对小鼠体质量的调控作用与可能机制。方法从大鼠下丘脑及周围组织中提取富含MC4R的膜蛋白,采用放射性配体受体结合分析,比较并找出与MC4R具有高亲和力的α-MSH类似化合物。用LANCETMcAMP384在稳定转染MC4R的HEK293细胞上测试α-MSH类似化合物对cAMP释放的影响,确定其激动活性。采用高脂饲料喂养的小鼠,将筛选出的化合物经脑室给药一定时间后,观察小鼠体质量、摄食量及血糖、血脂、瘦素及胰岛素的变化,在整体水平上分析药物效果。结果受试化合物中LK-SPL-024对脑内MC4R亲和力最高。cAMP释放实验证明LK-SPL-024与α-MSH性质相同,均为MC4R激动剂,且激动活性与α-MSH相当。脑室注射给药,与生理氯化钠溶液对照组相比能有效减少肥胖小鼠进食量,显著降低血糖、血脂浓度并提高瘦素、胰岛素浓度;具有明显降低肥胖小鼠体质量的作用。结论本研究从α-MSH类似化合物中筛选得到了与MC4R高亲和力结合的化合物LK-SPL-024,该化合物是MC4R的激动剂,具有明确的减肥效应,机制可能与其升高血清瘦素和胰岛素水平有关。

鸽黑素皮质素受体3、4(MC3R、MC4R)基因多态性与生长性状的相关分析

利用PCR-SSCP技术和DNA测序方法检测广东石岐肉鸽和哈尔滨地区灰色家鸽MC3R和MC4R基因部分编码区序列的单核苷酸多态性,分析了MC3R基因T91G突变位点和MC4R基因A903G突变位点导致的基因型与两群体鸽生长和体组成性状的关系。结果表明,这两个多态位点所导致的基因型对石岐肉鸽活重、屠体重、全净膛重均有显著影响(P<0.05);另外,利用这两个突变位点所产生的合并基因型在鸽群体中与生长和体组成性状作最小二乘分析,结果表明,两位点合并后的基因型对全净膛重影响显著(P<0.05)。多重比较结果表明,BBAA型全净膛重显著大于AABB型,BBAA型对于体重增长是有利基因型。

黑皮质素受体-4:生物学特征、作用机理和影响因素

黑皮质素受体4(MC4R)是G-蛋白耦联受体(GPCR),是下丘脑分泌的一种肽类物质,在调控动物采食量中起着重要的作用。MC4R与阿黑皮质素原(POMC)分泌的α-促黑素(α-MSH)结合,激活下丘脑MC4R神经元的表达,从而抑制采食量。本文综述了MC4R的生物学特征及其在动物采食量调控中的作用机理,并阐述了影响MC4R活性的因素。

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。

黑皮质素受体-4调节通路的研究进展

黑皮质素系统来自阿片-促黑素细胞皮质素原,在中枢摄食行为和能量平衡代谢中起到重要作用,此系统生理功能的发挥主要通过与下丘脑神经元细胞上特定膜受体(黑皮质素受体)结合完成。黑皮质素受体(MCR)有五种亚型(MC1R-MC5R),其中参与体重调节的受体主要是黑皮质素受体3(MC3R)和黑皮质素受体4(MC4R)。MC4R属于G蛋白耦联受体,具有七次跨膜结构。作为一种膜受体,MC4R发挥体重调节作用,一方面受外界激动剂或拮抗剂的调节;另一方面,此受体活化后会影响到细胞内的信号调节通路。研究MC4R的功能首先要了解受体的结构,本文对G蛋白耦联受体的结构进行了较详细的叙述,MC4R经信号调节通路,激活腺苷酸环化酶,增加cAMP的浓度,最终通过影响细胞内基因的转录和翻译,来调节体重和能量的消耗。

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。

石家庄市体检人群超重和肥胖的患病情况及与黑素皮质素4受体基因rs17782313位点多态性的关系

目的了解2011年石家庄市体检人群超重、肥胖流行特征,并探讨黑素皮质素4受体(MC4R)基因rs17782313位点多态性与肥胖的关系。方法选取2011年河北省人民医院体检中心48 831例18岁以上体检者的体检资料,对其超重、肥胖现状及影响因素进行流行病学分析。应用直接测序法对其中的3 000例肥胖者(肥胖组)和1 000例正常体质量者(对照组)MC4R基因rs17782313位点多态性进行分析,比较两组的基因型和等位基因频率分布情况。结果 48 831例体检者中,体质指数(BMI)平均(24.7±5.1)kg/m2,腰围平均(84.3±32.5)cm,超重、肥胖检出率分别为37.98%(18 547/48 831)、16.62%(8 117/48 831)。男性超重、肥胖检出率〔45.05%(12 513/27 775)和21.78%(6 049/27 775)〕高于女性〔28.66%(6 034/21 056)和9.82%(2 068/21 056)〕(P<0.05)。无论是男性还是女性,不同年龄的体检人群中超重、肥胖检出率间有差异(P<0.05)。肥胖组患者MC4R基因rs17782313位点的基因型、等位基因的频率分布与对照组比较有差异(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,MC4R CC基因型是肥胖的独立危险因素〔OR=2.600,95%CI(1.418,4.764)〕。结论石家庄市体检人群超重和肥胖检出率高;MC4R基因rs17782313位点多态性与肥胖有关。

金华猪促黑激素皮质素受体4基因多态性分析

应用PCR-RFLP方法对金华猪Ⅰ系(154头)、金华猪Ⅱ系(41头)和金华猪Ⅲ系(53头)的MC4R基因的1269～1494bp区段进行扩增,并用TaqI酶进行酶切,比较了MC4R酶切后基因型频率分布情况。结果表明,AA基因型频率在金华猪上较高达到0.9194,在Ⅱ系中最高达到0.9512,Ⅲ系次之达到0.9434,Ⅰ系最低达到0.9026,而金华猪的AB基因型和BB基因型频率都较低分别为0.0565和0.0242。

α-促黑激素类似物与黑素皮质素受体3和4亲和活性的筛选

目的:筛选具有中枢黑素皮质素受体3和4(melanocortin 3 and 4 receptors,MC3R,MC4R)高亲和活性和选择性的新化合物(α-促黑激素类似物)。方法:从大鼠下丘脑及周围组织中提取富含MC3R和MC4R的膜蛋白,进行放射标记的α-促黑激素([125I]-NDP-α-MSH)配体与MC3R,MC4R的结合实验,求出受体最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。用10 nmol.L-1浓度的与MC3R和MC4R高亲和活性的已知激动剂(PT141)和已知阻滞剂(SHU9119)及各受筛化合物进行竞争结合或抑制实验,比较并找出与MC3R和MC4R具有高亲和活性的新化合物。结果:饱和实验求出Bmax=64.81 pmol.g-1蛋白,Kd=0.768 2 nmol.L-1。受筛化合物中LK-FS024与MC3R和MC4R的亲和活性最高,与PT141几乎相同(相对结合率为97%)。结论:LK-FS024与MC3R和MC4R有较高亲和活性,可能是一个具有较好药理研究价值的α-MSH类似药。

α-黑素细胞刺激素及黑皮质素受体-4在能量平衡和繁殖中的功能研究

阿片黑素促皮质激素原(POMC)是黑皮质激素的前体物质,在机体中广泛分布。近年来,POMC及其衍生物黑素细胞刺激素(MSH)和黑皮质素受体-4(MC4R)在能量稳态和繁殖活动中的作用备受关注。研究发现,POMC神经元及其加工后的产物对摄食和体重的调节具有重要作用。此外,POMC神经元在下丘脑中与GnRH神经元紧密接触,由其产生的神经递质和神经肽可能对GnRH神经元具有重要的输入作用,从而直接或间接地调控下丘脑–垂体–性腺轴(HPG)中繁殖相关激素的合成并影响生殖活动。本文综述了黑皮质素系统对能量稳态和繁殖活动的调控作用以及目前MC4R在硬骨鱼类中的药理学研究,以期其能够在动物的生长发育和繁殖中具有应用前景。

黑皮质素受体4基因rs17782313位点基因多态性与减重手术治疗肥胖症患者的减重效果的关系

目的:研究我国北方汉族肥胖症患者黑皮质素受体4(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因的rs17782313位点基因多态性对腹腔镜Roux-en-Y胃旁路术(1aparoscopic Roux-en-Y gastric bypass,LRYGB)减重效果的影响。方法:回顾性分析中国医科大学附属盛京医院2011年1月至2013年12月收治的81例病态性肥胖接受LRYGB治疗的患者临床资料,提取患者外周血DNA,PCR扩增目的基因后应用直接测序法,对rs17782313位点基因型进行检测。根据基因型分组:风险基因携带组和非携带组,比较分析2组代谢指标、体质指数(body mass index,BMI),多余体质量减少率(excess weight loss,EWL)等术后变化,评价该基因对减重效果的影响。结果:(1)rs17782313位点的3种基因型TT、TC、CC,基因频率分别为50.62%(41例)、35.80%(29例)、13.58%(11例)。(2)不同基因型的各组间,体质量、BMI、血脂、空腹血糖、糖化血红蛋白等指标无明显差异。(3)风险基因携带者术后BMI、EWL下降少于非携带者,但未达到统计学差异(女性患者BMI术后6个月P=0.296,12个月P=0.179;EWL P=0.139,0.094。男性患者BMI术后6个月P=0.295,12个月P=0.072;EWL P=0.106,0.077)。结论:MC4R基因rs17792313位点C等位基因(风险基因)携带者与非携带者的减重效果相似。

黑皮质素受体-4在正常大鼠瘦素诱发交感神经活性和压力感受性反射功能变化中的作用

目的探讨黑皮质素受体-4(MC4R)在瘦素(LPN)诱发的正常大鼠交感神经活性(SNA)和压力感受性反射功能变化中的作用。方法将正常SD大鼠20只随机分为室旁核(PVN)-人工脑脊液(aCSF)组和PVNSHU9119组,分别在双侧PVN显微注射aCSF和MC4R抑制剂SHU9119,每组10只。两组大鼠于侧脑室注射LPN0 h、LPN 1 h后绘制压力感受性反射曲线;继续注射LPN的同时分别在PVN显微注射aCSF和MC4R抑制剂SHU9119,并绘制压力感受性反射曲线,同时记录注射LPN 0 h、LPN 1 h及PVN注射aCSF或SHU9119后的基础血压(MAP)、HR、SNA值。结果 PVN-aCSF组和PVN-SHU9119组中,与本组注射LPN 0 h相比,注射LPN 1 h后和PVN注射后的SNA、HR均升高(P均<0.05),但PVN注射SHU9119后的SNA、MAP及HR值均低于同时期PVNaCSF组的对应值(P均<0.05)。两组交感神经压力感受性反射功能参数比较,与各自注射LPN 0 h相比,注射LPN 1 h后和PVN注射后的Max、Min均升高(P均<0.05),PVN-SHU9119组的Max低于同时间PVN-aCSF组的对应值(P<0.05)。两组心率压力感受性反射功能参数比较,与本组注射LPN 0 h相比,注射LPN 1 h后和PVN注射后的Max、BP50均升高(P<0.05),但PVN注射SHU9119后的Max低于注射LPN 1 h后的Max(P<0.05)。PVNSHU9119组的Max、Min、BP50值低于同时间PVN-aCSF组(P<0.05)。结论 PVN的MC4R部分参与LPN诱发的正常大鼠交感神经活性和压力感受性反射功能增强。

黑皮质素受体4激动剂研究进展

分布在中枢神经系统的黑皮质素受体4(melanocortin receptor4,MC4R)具有控制食欲、调节体脂平衡以及改变性行为等作用,其激动剂可用于肥胖和性功能障碍的治疗。本文综述了MC4R肽类和非肽类激动剂的研究进展。

犬黑皮质素受体-4突变体D298N真核表达载体的构建及其在MDCK细胞中的表达

[目的]引进犬MC4R突变点,构建突变体D298N表达载体并在MDCK细胞中获得表达。[方法]设计带突变点D298N引物,以犬MC4R基因组DNA为模板,采用普通PCR和Overlap-PCR扩增编码区,将产物克隆、酶切、测序鉴定。将测序正确的基因连接到pcDNA3.1-myc-His/A载体上,将重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N酶切、鉴定,将测序正确的重组体转染到MDCK细胞中,继续培养3 d,提取细胞总RNA,并采用RT-PCR方法检测基因表达。提取细胞总蛋白,Western Blot鉴定蛋白表达。[结果]构建带D298N突变点的真核表达载体,提取质粒后有2处碱基不同,分别是777位碱基T→C,892位碱基G→A(引入的突变位点)。转染到MDCK后,RT-PCR和Western Blot均检测到重组体在基因水平和蛋白水平的表达。[结论]成功构建犬的重组体真核表达载体并在MDCK细胞中表达。