黑素瘤相关抗原-A9和-A11在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨黑素瘤相关抗原(melanoma antigen,MAGE)-A9和-A11在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况,分析其与食管癌患者临床病理学特征及其预后的关系。方法:选取河北医科大学第四医院2010年9月至2010年11月住院手术切除的食管癌组织及距癌组织边缘5 cm以上且病理诊断证实为正常组织的癌旁组织标本各60例,同时选取5例该院前列腺癌住院患者术后的睾丸组织作为阳性对照,应用免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织及相应癌旁组织中MAGE-A9和-A11蛋白的表达。结果:食管鳞状细胞癌组织中MAGE-A9和MAGE-A11蛋白的阳性表达率分别为45%(27/60)和66.67%(40/60),而相应的癌旁组织未发现MAGE-A9和-A11蛋白的表达。MAGE-A9蛋白的表达与食管鳞状细胞癌患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移均无相关性(P>0.05),但与组织学分级相关(P<0.05);MAGE-A11蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者的年龄、组织学分级、淋巴转移均无相关性(P>0.05),但与临床分期、肿瘤大小呈正相关(P<0.05)。Log-Rank检验显示,MAGE-A9(P=0.037)和-A11(P=0.039)蛋白表达阳性的食管鳞状细胞癌患者和贲门腺癌患者的生存期均显著低于其表达阴性的患者。Cox多因素分析提示,MAGE-A9(P=0.026)和MAGE-A11(P=0.038)蛋白表达、组织学分级(P=0.026)、临床分期(P=0.008)及淋巴结转移(P=0.010)可作为整体生存的独立预后因素。结论:MAGE-A9和-A11蛋白是食管鳞状细胞癌的特异性抗原,似可作为食管鳞状细胞癌预后不良的预测指标。

黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。

非小细胞肺癌中黑素瘤相关抗原D4基因启动子甲基化的检测及其临床意义

目的:分析非小细胞肺癌(NSCLC)中黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因启动子甲基化程度与MAGE-D4 mRNA表达水平及患者临床病理特征的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测38例NSCLC患者癌组织及其癌旁组织中MAGE-D4启动子甲基化程度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测组织中MAGE-D4 m RNA相对表达量,分析MAGE-D4启动子甲基化频率与患者临床病理特征的关系。结果:肺癌组织中MAGE-D4基因甲基化频率为23.68%,明显低于癌旁组织的86.84%(P<0.05);而癌组织中MAGE-D4 m RNA表达水平则显著高于癌旁组织(5.49±5.65 vs.1.44±1.08,P<0.05),MAGE-D4表达量与启动子甲期化程度呈负相关关系(r=-0.663,P<0.05)。肿瘤直径>3 cm的肺癌患者MAGE-D4甲基化发生率明显低于肿瘤直径≤3 cm患者(P<0.05)。结论:NSCLC中MAGE-D4基因转录活性的增强与其启动子低甲基化相关;肿瘤直径较大的NSCLC患者MAGE-D4甲基化发生率较低。

人黑素瘤相关抗原D4原核表达条件的优化

目的:探索黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因工程菌原核诱导表达的最佳条件,以提高目的蛋白产量。方法:设置不同宿主菌(DH5α、TB1、Rosetta)、诱导时机(重组菌分别培养0.5~3h后进行诱导)、诱导剂IPTG浓度(0.1~0.9mmol/L)和诱导时间(1~8h)等条件,诱导MAGE-D4重组质粒表达,通过SDS-PAGE电泳和ImageJ软件扫描电泳图谱的方法,对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法对35例肝癌患者血清MAGE-D4抗体进行检测,分析MAGE-D4融合蛋白的免疫活性。结果:将重组质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,菌液OD600达到0.8时加入IPTG至终浓度0.9mmol/L,37℃诱导培养7h,可有效提高目的蛋白的表达量。可溶性MAGE-D4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的25.5%。肝癌患者血清中MAGE-D4抗体的阳性率为28.57%(10/35),其MAGE-D4抗体平均效价明显高于正常人(P<0.05)。结论:本研究优化了MAGE-D4融合蛋白的原核表达条件,获得了可溶性、具有免疫活性的重组蛋白。

黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构建

目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表达质粒连接,转化大肠杆菌。连接产物经抗生素筛选、酶切、测序鉴定后,通过脂质体转染A549肺癌细胞。结果MAGE-D4蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,二级结构以α螺旋为主,具有多个功能性修饰位点,主要定位在细胞核。SLLLVILGV可能为MAGE-D4来源的HLA-A*0201限制性T细胞表位。与MAGE-D4存在潜在相互作用的前3位蛋白依次是染色体成分4非结构维持蛋白同源物A(NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MLANA/MART-1)、黑素瘤B抗原5(BAGE5)。测序结果证实重组质粒含有MAGE-D4的全长编码序列(CDS),能成功转染A549肺癌细胞。结论MAGE-D4蛋白为不稳定核蛋白,可通过与多种黑素瘤相关蛋白相互作用而发挥功能,其来源的短肽可能具有较强的免疫原性,并构建了MAGE-D4真核表达载体。

Ad5/F35-MAGE-A3的构建及其对黑素瘤患者DC成熟和凋亡的影响

目的:构建含人黑素瘤相关抗原3(melanoma-associated antigen 3,MAGE-A3)的重组5/35型腺病毒(adenovirus serotype 5/35,Ad5/F35),观察腺病毒介导的MAGE-A3过表达对黑素瘤患者树突状细胞(dendritic cell,DC)的成熟和凋亡的影响。方法:选择转染效率最高的腺病毒载体,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒颗粒Ad5/F35-MAGE-A3。免疫组化和Western blotting检测Ad5/F35-MAGE-A3感染对健康人、肾癌患者及黑素瘤患者DC中MAGE-A3表达的影响,流式细胞术检测Ad5/F35-MAGE-A3感染对黑素瘤患者DC成熟和凋亡的影响。结果:成功构建了含人MAGE-A3的重组腺病毒载体并包装腺病毒颗粒Ad5/F35-MAGE-A3,病毒感染滴度为7.94×108IU/ml。Ad5/F35-MAGE-A3感染显著提高了健康人和肾癌患者DC中MAGE-A3的表达(P<0.05),不影响黑素瘤患者DC中MAGE-A3的表达[(0.3352±0.1272)vs(0.4672±0.0704),P>0.05]。Ad5/F35-MAGE-A3感染后黑素瘤患者DC共刺激分子CD80[(20.42±0.58)%vs(10.22±1.04)%、(8.95±0.2)%]、CD86[(85.3±3.98)%vs(39.85±2.86)%、(34.1±4.32)%]和HLA-DR[(86.87±4.36)%vs(63.68±3.15)%、(60.69±4.81)%]的表达明显高于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05),但DC凋亡率无显著差异[(1.18±0.09)%vs(1.09±0.11)%,P>0.05]。结论:重组腺病毒载体Ad5/F35-MAGE-A3能够高效转染黑素瘤患者的DC,感染后不影响MAGE-A3在DC中的表达,能够促进DC的成熟,无明显细胞毒作用。

MAGEA4和MAGEC1基因在肝细胞癌组织中表达变化及潜在转录调控机制的生物信息学分析

目的基于生物信息学方法观察MAGEA4和MAGEC1在肝细胞癌(HCC)组织中的表达水平,分析其对患者预后的影响,及其潜在的转录调控机制。方法从TCGA和GEO数据库收集HCC高通量数据集TCGA-LIHC、GSE10143、GSE20140、GSE87630和GSE107170,比较MAGEA4和MAGEC1在HCC组织与癌旁肝组织中表达的差异。采用Pearson相关法分析MAGEA4和MAGEC1在HCC组织中表达的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,以中位数区分MAGEA4和MAGEC1的高表达和低表达,依据曲线下面积(AUC)评估MAGEA4和MAGEC1表达区分HCC和癌旁正常肝组织的能力。采用Kaplan-Meier法分析MAGEA4和MAGEC1在HCC中的预后意义;通过ENCORI和Cistrome DB预测调控MAGEA4和MAGEC1表达的转录因子和miRNA。结果在纳入的5个数据集中,MAGEA4和MAGEC1在HCC组织中的表达水平均高于癌旁正常肝组织(P均<0.05)。在TCGA-LIHC、GSE10143、GSE107170数据集中,MAGEA4与MAGEC1在HCC组织中的表达均呈正相关(r分别为0.322、0.299、0.482,P均<0.01)。MAGEA4区分HCC和癌旁正常肝组织具有轻到中度准确性,MAGEC1区分HCC和癌旁正常肝组织具有轻到高度准确性。在HCC组织中,MAGEA4与MAGEC1表达呈正相关(r=0.306,P<0.01)。MAGEA4高表达与HCC患者的不良预后相关。与MAGEA4和MAGEC1均具有靶向关系的miRNA为hsa-miR-1827,与MAGEA4、MAGEC1具有潜在调控关系的转录因子为MYC和TFAP2A。结论MAGEA4和MAGEC1在HCC组织中表达升高,且MAGEA4高表达是HCC预后的危险因素;hsa-miR-1827及转录因子MYC、TFAP2A可能共同参与调控MAGEA4和MAGEC1的表达。

卵巢癌组织中MAGE-A9、HER2的表达变化及其意义

目的观察卵巢癌组织中黑色素瘤相关抗原A9(MAGE-A9)、人类表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法选择240例行子宫、双侧输卵管卵巢切除术的患者,其中术后病理检查确诊为卵巢癌128例(观察组)、非卵巢癌112例(对照组)。采用免疫组化法检测观察组卵巢癌组织和对照组正常卵巢、输卵管组织中的MAGE-A9、HER2蛋白,分析MAGE-A9、HER2蛋白表达与卵巢癌临床病理参数及患者预后的关系。结果观察组51例(39.84%)患者卵巢癌组织中MAGE-A9蛋白高表达,对照组正常卵巢、正常输卵管组织中未见MAGE-A9蛋白高表达,两组相比,P均<0.05。观察组40例(31.25%)患者卵巢癌组织中HER2蛋白高表达,对照组4例(16.67%)患者正常卵巢组织中HER2蛋白高表达,未见正常输卵管组织中HER2蛋白高表达,两组相比,P均<0.05。卵巢癌组织MAGE-A9、HER2蛋白表达与FIGO分期、肿瘤分化程度、CA125水平以及淋巴结转移有关(P均<0.05)。MAGE-A9高表达以及MAGE-A9/HER2均高表达的卵巢癌患者5年生存率低(P<0.001)。结论卵巢癌组织中MAGE-A9、HER2高表达。检测卵巢癌组织中MAGE-A9、HER2表达有助于判断病情及评估患者预后。

MAGE－A基因亚家族及其在肿瘤临床上的应用前景

黑素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)-A基因亚家族属于癌睾丸抗原家族,其定位于X染色体,包括MAGE-A1～MAGE-A12共12个成员。对MAGE-A在基因和蛋白水平的研究发现,其在正常组织中几乎不表达,而在多种肿瘤组织中均有较高水平的表达,并且往往表达一种以上的MAGE-A亚型。正常情况下,由于CpG岛高度甲基化,MAGE-A基因沉默表达。受辐射等因素影响时,基因组易发生去甲基化,促使MAGE-A基因表达。组蛋白的乙酰化也与MAGE-A的表达有关。MAGE-A作为肿瘤相关抗原,与肿瘤的发生、发展、耐药及较差的预后密切相关。由于MAGE-A特异性的表达于多种肿瘤,对MAGE-A亚型的检测尤其是多种亚型的联合检测有助于MAGE-A阳性肿瘤的诊断。此外,MAGE-A基因编码的抗原肽由MHCⅠ分子提呈至细胞毒性T细胞,从而发挥抗肿瘤活性。应用MAGE-A抗原肽的肿瘤疫苗已经投入临床试验,并取得了良好的治疗效果。

MAGE-A9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中P53转录活性及功能的影响

目的:探讨黑素瘤相关抗原-A9(melanoma-associated antigen,MAGE-A9)对人乳腺癌细胞中P53转录活性及功能的影响。方法:通过LipofectamineTM2000体外转染质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0-p53、pCMV6-MAGE-A9和pcDNA3.0-p53/MAGE-A9至人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting检测细胞中p21WAF1mRNA和蛋白的表达,荧光素酶报告基因分析检测细胞中p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达活性,MTT法检测转染不同质粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果:转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞中p21WAF1mRNA和蛋白表达水平均明显低于pcDNA3.0-p53组[(0.15±0.01)vs(0.18±0.02),(0.03±0.00)vs(0.06±0.01);均P<0.05]。转染pcDNA3.0-p53质粒可以增强MDAMB-231细胞中p21WAF1启动子介导的荧光素酶的表达[(58.56±3.47)vs(1.00±0.12),P<0.01],转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9后,MDA-MB-231细胞中p21WAF1启动子介导的荧光素酶的表达较转染pcDNA3.0-p53组明显降低[(22.02±4.91)vs(58.56±3.47),P<0.05]。与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-p53组MDA-MB-231细胞增殖率明显明显降低[(228.89±22.39)%vs(337.23±23.67)%,P<0.05];而pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞增殖率明显高于pcDNA3.0-p53组[(291.51±5.91)%vs(228.89±22.39)%,P<0.05]。结论:MAGE-A9可抑制MDA-MB-231细胞中P53的转录活性及细胞增殖。

白细胞介素-24与银屑病

白细胞介素-24(IL-24)是一种新的细胞因子,最初被命名为黑素瘤分化相关抗原-7(MDA-7),归属于IL-10家族成员。它通过IL-20R1/IL-20R2与IL-22R1/IL-20R2二对异源二聚体受体传导信号。IL-24主要来源于激活的单核细胞和Th2细胞。有研究者认为在银屑病患者皮损中,IL-24可导致IL-24受体的持续激活及表皮下附近细胞因子激活,刺激细胞增殖,导致银屑病的发生;另有研究者认为IL-20/IL-24基因单倍体CAAAC,TGGGT和CGAGT在斑块状银屑病发病过程中具有保护作用。

肿瘤免疫治疗的研究进展

肿瘤免疫治疗通过调动或激发机体自身的免疫功能,增强肿瘤周围微环境中各种抗肿瘤能力,从而抑制和杀伤肿瘤细胞。相对于传统的肿瘤治疗方法,肿瘤免疫治疗具有自身特有的诸多优势,也可提高传统治疗方法的疗效,减轻传统治疗方法的不良反应。本文就肿瘤相关抗原、肿瘤免疫治疗的分类、肿瘤免疫治疗与传统肿瘤治疗手段的联合应用、以及肿瘤免疫治疗的优势等方面相关的研究进展进行综述。