黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用。方法对构建的p MAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位。结果获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6%(17/23)。结论制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。

黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)的生物信息学分析及真核表达载体的构建

目的分析黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)蛋白的理化性质、结构和功能,构建MAGE-D4真核表达载体。方法通过生物信息学软件分析MAGE-D4蛋白的理化性质、结构和功能。以MAGE-D4/pMAL-C2原核重组质粒为模板,经PCR扩增、酶切后与pEGFP-C1真核表达质粒连接,转化大肠杆菌。连接产物经抗生素筛选、酶切、测序鉴定后,通过脂质体转染A549肺癌细胞。结果MAGE-D4蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,二级结构以α螺旋为主,具有多个功能性修饰位点,主要定位在细胞核。SLLLVILGV可能为MAGE-D4来源的HLA-A*0201限制性T细胞表位。与MAGE-D4存在潜在相互作用的前3位蛋白依次是染色体成分4非结构维持蛋白同源物A(NSMCE4A)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MLANA/MART-1)、黑素瘤B抗原5(BAGE5)。测序结果证实重组质粒含有MAGE-D4的全长编码序列(CDS),能成功转染A549肺癌细胞。结论MAGE-D4蛋白为不稳定核蛋白,可通过与多种黑素瘤相关蛋白相互作用而发挥功能,其来源的短肽可能具有较强的免疫原性,并构建了MAGE-D4真核表达载体。

非小细胞肺癌中黑素瘤相关抗原D4基因启动子甲基化的检测及其临床意义

目的:分析非小细胞肺癌(NSCLC)中黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因启动子甲基化程度与MAGE-D4 mRNA表达水平及患者临床病理特征的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测38例NSCLC患者癌组织及其癌旁组织中MAGE-D4启动子甲基化程度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测组织中MAGE-D4 m RNA相对表达量,分析MAGE-D4启动子甲基化频率与患者临床病理特征的关系。结果:肺癌组织中MAGE-D4基因甲基化频率为23.68%,明显低于癌旁组织的86.84%(P<0.05);而癌组织中MAGE-D4 m RNA表达水平则显著高于癌旁组织(5.49±5.65 vs.1.44±1.08,P<0.05),MAGE-D4表达量与启动子甲期化程度呈负相关关系(r=-0.663,P<0.05)。肿瘤直径>3 cm的肺癌患者MAGE-D4甲基化发生率明显低于肿瘤直径≤3 cm患者(P<0.05)。结论:NSCLC中MAGE-D4基因转录活性的增强与其启动子低甲基化相关;肿瘤直径较大的NSCLC患者MAGE-D4甲基化发生率较低。

人黑素瘤相关抗原D4原核表达条件的优化

目的:探索黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)基因工程菌原核诱导表达的最佳条件,以提高目的蛋白产量。方法:设置不同宿主菌(DH5α、TB1、Rosetta)、诱导时机(重组菌分别培养0.5~3h后进行诱导)、诱导剂IPTG浓度(0.1~0.9mmol/L)和诱导时间(1~8h)等条件,诱导MAGE-D4重组质粒表达,通过SDS-PAGE电泳和ImageJ软件扫描电泳图谱的方法,对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法对35例肝癌患者血清MAGE-D4抗体进行检测,分析MAGE-D4融合蛋白的免疫活性。结果:将重组质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,菌液OD600达到0.8时加入IPTG至终浓度0.9mmol/L,37℃诱导培养7h,可有效提高目的蛋白的表达量。可溶性MAGE-D4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的25.5%。肝癌患者血清中MAGE-D4抗体的阳性率为28.57%(10/35),其MAGE-D4抗体平均效价明显高于正常人(P<0.05)。结论:本研究优化了MAGE-D4融合蛋白的原核表达条件,获得了可溶性、具有免疫活性的重组蛋白。

食管鳞癌组织中黑色素瘤相关抗原D4b的表达及临床意义

目的:探讨黑色素瘤相关抗原D4b(melanoma associated antigens-D4b,MAGE-D4b)在食管鳞癌(ESCC)组织中的表达及其与临床病理因素之间的关系。方法:采用免疫组织化学法检测75例食管鳞癌石蜡标本和36例正常食管黏膜组织中MAGE-D4b蛋白表达情况。结果:ESCC中MAGE-D4b的表达水平明显高于正常食管黏膜中的表达水平(分别为42.7%和16.7%,P<0.01)。MAGE-D4b蛋白的阳性表达水平与食管鳞癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、肿瘤分化及AJCC分期等临床病理因素均无相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,食管鳞癌组织中MAGE-D4b阳性表达者的3年生存率低于阴性表达者(3年生存率:38.7%和69.2%,P=0.013)。单因素分析及Cox多因素分析均提示年龄、MAGED4b的表达及淋巴结转移是有意义的预后因素(P<0.05)。结论:MAGE-D4b蛋白在食管鳞癌组织中高表达,且其阳性表达与患者的3年生存率相关,MAGE-D4b蛋白可能为食管鳞癌的预后判断提供有意义的生物学指标。

MAGE-D4在人脑膜瘤组织中的表达及其意义

目的检测人脑膜瘤组织中黑色素瘤相关抗原MAGE-D4 m RNA的表达并分析其临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,检测36例脑膜瘤组织和8例正常人脑组织中MAGE-D4 m RNA的表达,分析MAGE-D4 m RNA的表达与脑膜瘤患者临床病理特征的关系。结果 MAGE-D4 m RNA在脑膜瘤组织中的阳性表达率为58.33%(21/36),明显高于正常人脑组织中的阳性表达率12.50%(1/8)(P<0.05);脑膜瘤组织中MAGE-D4 m RNA的表达与性别、年龄、肿瘤大小和病理类型等临床病理特征无关(P>0.05)。结论在脑膜瘤组织中MAGE-D4的表达率较高,提示MAGE-D4可能成为脑膜瘤免疫治疗的靶抗原。

人胶质瘤中HIF1A和MAGED4的表达及调控关系初探

目的探讨缺氧诱导因子1A(HIF1A)和黑色素瘤相关抗原D4(MAGED4)在人胶质瘤中的表达情况,并分析HIF1A对MAGED4表达的影响。方法通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集人胶质瘤组织样本数据681例,正常脑组织样本数据207例,比较其MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达水平。通过中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中下载693例胶质瘤患者的mRNA-seq_693数据集及相应的临床信息,分析MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达的相关性,以及二者与患者临床特征指标的关联性。应用氯化钴模拟体外缺氧环境,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印记(WB)实验探讨沉默胶质瘤细胞HIF1A表达对MAGED4表达变化的影响。结果基于GEPIA数据库的分析结果显示,低级别胶质瘤(LGG)和胶质母细胞瘤(GBM)组织的HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA水平均高于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.05)。基于CGGA数据库的分析结果显示,MAGED4 mRNA表达水平与HIF1A mRNA表达水平呈正相关(r=0.322,P=0.000)。MAGED4 mRNA高表达组年龄<40岁、异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变型的人数比例大于MAGED4 mRNA低表达组,差异有统计学意义(P<0.05),两组性别、肿瘤类型、世界卫生组织(WHO)肿瘤分级,O6-甲基鸟瞟-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化状态、1p/19q共缺失情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。将HIF1A siRNA转染至U87-MG和U251细胞,并在缺氧条件下培养48 h,RT-qPCR和WB实验结果显示,HIF1A下调后,MAGED4的表达水平也显著下降。结论HIF1A和MAGED4均高表达于胶质瘤,且两者呈正相关。胶质瘤细胞中HIF1A可调控MAGED4的表达。

乙型肝炎病毒相关性肾病中C4d沉积特点及其意义

乙型肝炎病毒相关性肾病（HBV—GN）有多种病理类型，其中不典型膜型和膜增殖型HBV—GN的发病机制被认为与乙型肝炎病毒抗原（HBV—Ag）在肾脏中沉积有关。但乙型肝炎病毒相关性IgA肾病（IgAN）是否与HBV—Ag沉积有关，目前仍有争议。补体片段C4d已被作为精确测定组织中体液免疫反应的一种标志物：本研究拟通过回顾性分析不同病理类型HBV—GN中C4d沉积的特点，及其与HBsAg和HBcAg沉积物的关系，

慢性移植物肾病中C4d沉积与抗波形蛋白抗体的相关性

慢性移植物肾病（CAN）是导致移植肾丢失的主要原因[1],其中体液免疫是导致这一现象的主要因素之一[2].抗波形蛋白抗体是一种常见的非人类白细胞抗原（HLA）抗体及自身抗体,在CAN进展中检测到抗波形蛋白抗体的存在.沉积于肾微血管部位的C4d分子是抗体介导的排斥反应的标志物.本研究旨在探讨CAN进展中抗波形蛋白抗体与C4d沉积的相关性.

乙型肝炎病毒相关性肾病中C4d沉积特点及其意义

乙型肝炎病毒相关性肾病（HBV—GN）有多种病理类型，其中不典型膜型和膜增殖型HBV—GN的发病机理被认为与乙型肝炎病毒抗原（HBV—Ag）在肾脏中沉积有关，但乙型肝炎病毒相关性IgA肾病（IgAN）是否与HBV—Ag沉积有关，目前仍有争议。

新疆维吾尔族人自然长寿与HLADRB、ACE基因的关联分析

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)DRB基因及血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性与新疆维吾尔族人自然长寿的关系。方法研究样本分为4组:第1组年龄≥100岁;第2组年龄为90～99岁;第3组年龄为70～90岁;第4组为65～70岁自然死亡者。分别应用聚合酶链反应序列特异引物法(PCRSSP)、单链构象多态性(SSCP)分析和直接测序技术对各组进行基因分型。结果百岁组HLADR1的频率明显高于对照组(分别为9.5%和1.9%,P<0.05);HLADR6(14)的频率也明显高于对照组(分别为9.5%和0.9%,P<0.05);HLADR6的频率明显高于其余3组;HLADR4的频率明显低于对照组(分别为9.5%和23.6%,P<0.05);HLADR9的频率明显低于对照组(分别为1.2%和9.4%,P<0.05)。相关分析显示:HLADR1及ACE基因的D等位基因与长寿呈正相关,而HLADR9呈负相关。结论HLADRB基因的DR1等位基因和ACE基因的等位基因D对长寿可能有保护作用;HLADRB基因的DR9等位基因可能是不利于长寿的危险因素,HLADRB基因多态性和ACE基因多态性相互作用对长寿有协同作用。

黑素瘤免疫联合治疗的进展及思考

以免疫检查点抑制剂为首的免疫治疗已成为黑素瘤的一线标准治疗手段,而程序性死亡因子1(programmed cell death-1,PD-1)抑制剂与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)抑制剂的联合应用,即免疫联合治疗进一步提高了药物的抗肿瘤效应,改善了患者的应答率,延长了患者的生存时间,因而成为黑素瘤治疗的新方向。与此同时,免疫联合治疗在其他多种肿瘤中的抗肿瘤效应也令人鼓舞。免疫联合治疗为患者提供了新的治疗选择,但同时也有诸多问题需要深入探讨。为使患者得到最大获益,如何优化联合治疗模式、如何选择合适的治疗人群、如何权衡患者风险获益等,都需要通过开展更多的大型临床研究予以解答。