鹅黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是其黑素皮质素受体MCR（MC1-5R）家族成员之一,属G蛋白偶联受体。它可与瘦蛋白、神经肽、α-黑素细胞刺激素等一起调节动物体重和采食量。参考鸡MC4R基因序列设计引物,克隆并测序了鹅MC4R基因。结果表明,鹅MC4R基因编码区全长996 bp,其核苷酸序列与鸡的同源性为95.3%,与人、牛、猪等哺乳动物同源性在75%-79%;其氨基酸序列与鸡的同源性达到98.5%。构建哺乳类、鸟类和鱼类MC4R基因核苷酸进化树显示,鹅较早地与哺乳类动物分化开来。分析MC4R蛋白的氨基酸残基特性参数表明,MC4R的7次跨膜结构与MC4R的亲水性区域、电荷密度以及氨基酸残基位于表面概率的变化规律相一致。

黑素皮质素受体-4的研究进展

黑素皮质素受体 4 (MC4R)是人类中枢神经系统中参与调节肥胖症发生的重要因素 ,可调节动物的体重和采食量。自MC4R基因克隆以来 ,学者们对MC4R的结构 ,生理功能 ,调控 ,作用机制及其基因突变与体重的关系等方面进行了大量的研究。

雷公山山区放牧山羊黑素皮质素受体-4mRNA表达的研究

为研究放牧山羊黑素皮质素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)mRNA表达水平的组织差异和品种差异,试验以β-actin基因为内参,应用双标准曲线法实时荧光定量PCR技术检测放牧饲养的黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊的7个组织MC4R基因mRNA的表达水平。结果表明,5个放牧山羊品种7种组织中均有MC4R mRNA表达,其水平以皮下脂肪和肾脏最高,肝脏其次,肺脏和心脏第三,半膜肌和背最长肌最低。肝脏MC4R mRNA的表达水平无品种差异,皮下脂肪、肾脏、肺脏、心脏、半膜肌和背最长肌MC4R mRNA的表达水平都以贵州白山羊最高。结果提示,放牧山羊MC4R mRNA的表达水平存在组织差异。除肝脏以外,其余组织MC4R mRNA的表达水平存在品种差异。本研究为开展放牧山羊的生长、胴体、肉质等性状的分子标记辅助选择育种奠定了基础。

鸡黑素皮质素受体-4反向激动剂细胞筛选模型的建立

本试验旨在建立体外鸡黑素皮质素受体-4(cMC4R)反向激动剂的细胞筛选模型,为从中草药中筛选出能与cMC4R作用且存在活性的中药成分提供一些基础性的研究。将成功构建的cMC4R真核表达质粒cMC4RpcDNA3.1(+)-myc与报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]按1∶5的比例共转染到CHO-K1细胞,两周后经有限稀释法获得单克隆;将获得的单克隆分别用CRE激活剂Forskolin和MC4R激动剂NDP-MSH作用6h,挑选萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的单克隆作为阳性细胞株;提取阳性细胞总RNA,RT-PCR检测阳性细胞内cMC4R基因、荧光素酶报告基因的转录水平;对MC4R激动剂NDP-MSH的终浓度、NDP-MSH孵育时间及溶剂DMSO的终浓度进行优化,应用Z’因子对筛选方法进行评估。结果显示,获得了5个单克隆(A2、F7、F8、F9、H10),其中单克隆A2的萤火虫荧光素酶的相对表达量最高,将其作为阳性细胞株;RT-PCR在预期位置扩增出大小分别为996和1 653bp的两条目的条带;激动剂NDP-MSH终浓度为10-9 mol/L、NDP-MSH孵育时间为8h、溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z’因子为0.82。结果表明,本试验所建立的筛选方法可靠、稳定,细胞筛选模型可用于cMC4R反向激动剂的筛选,为进一步从中药中筛选出有效物质奠定了基础。

犬黑素皮质素受体-4裸质粒注射促进小鼠肥胖的研究

[目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)cDNA的重组真核表达质粒对小鼠肥胖的影响。[方法]3次尾静脉高压注射pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R质粒,RT-PCR成功验证小鼠体内犬MC4R表达后,适时监测每只小鼠的体重,同窝小鼠相互对照,利用两两比较的秩和检验进行统计学分析。另外,用脂肪组织病理切片分析小鼠皮下脂肪细胞变化。[结果]试验得出,小鼠体重变化有统计学意义;饲养时间相同、相互对照组的每一组小鼠脂肪细胞直径对比明显,且具有统计学意义。[结论]犬MC4R基因在小鼠体内表达,能促进小鼠体重增加,为犬MC4R调节肥胖机制的研究提供理论依据。

黑素皮质素受体-4基因突变致重度肥胖合并重症肺炎一例

目的探讨黑素皮质素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因突变致重度肥胖合并重症肺炎患儿的临床表现、诊断及治疗特点。方法回顾性分析1例MC4R基因突变相关重度肥胖合并重症肺炎患儿的临床资料及诊治经过。结果1例15岁患儿因"咳嗽2周,呼吸困难半天"入我院治疗。患儿10岁确诊存在MC4R基因突变,入院时体重200 kg(BMI 76 kg/m^(2)),属于重度肥胖患儿,针对患儿重度肥胖合并重度肺炎的情况,我们采取了特殊呼吸治疗技术(肺保护性通气策略、体位管理等)、营养支持、早期康复等综合诊疗措施,最终患儿病情好转出院。结论MC4R基因突变可引起早发性肥胖,此类患儿合并重症肺炎时往往比较危重,临床诊疗需要采取一系列特殊的综合干预措施,指导患儿及家属出院后进行家庭机械通气及定期随访也是治疗策略中不可或缺的环节。

绵羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊MC4R基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛MC4R基因序列设计引物,采用PCR技术克隆绵羊MC4R基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的绵羊MC4R基因全长1 919 bp,含有999 bp的完整CDS编码区,编码332个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与牛、人、猪、大鼠、小鼠MC4R基因对应序列的同源性分别为95.2%、68.8%、82.7%、76.6%、77.1%,预测的氨基酸序列同源性分别为97.0%、92.8%、93.7%、92.2%、91.6%。组织表达谱分析表明MC4R基因在各组织均不同程度的表达,其中在大脑表达量很高,其他组织较低。生物信息学预测MC4R蛋白功能发现,绵羊的MC4R蛋白存在7个跨膜螺旋结构域,同时预测MC4R存在10个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。结果表明,MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。

MC4R与肥胖关系的研究新进展

黑素皮质激素受体-4(Melanocortin receptor-4,MC4R)是人类中枢神经系统中参与调节肥胖发生的重要调节因子,主要通过调节食物摄入、能量消耗来实现控制体重,从而调节肥胖的发生和发展。本文通过综述MC4R的作用机制、临床应用,介绍MC4R激动剂应用肥胖临床治疗的最新研究进展,从而为MC4R与肥胖的研究提供参考。

猪MC4R基因突变体真核表达载体的构建及功能研究

为研究MC4R基因不同突变体的功能差异,本研究从猪肌肉组织中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pcDNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体MC4R1,将载体转染BHK细胞后Western blotting检测蛋白表达。通过点突变法得到MC4R基因在707/892位点的3个突变载体,将突变载体瞬时转染到BHK细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞检测荧光表达,结果发现,克隆的MC4R1基因序列长度大约1 000bp,在707/892位点序列为G/G,将构建的真核表达载体MC4R1转染BHK细胞,经过Western blotting检测发现MC4R1蛋白正常表达;通过点突变法得到在707/892位点突变的突变载体MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4(A/A),经过激光共聚焦观察荧光表达后发现,突变受体在细胞膜上均有正常表达,流式检测发现4个突变受体表达的荧光平均强度并没有显著差异(P>0.05)。通过构建MC4R基因突变载体后发现,707/892位点突变对于MC4R受体在细胞膜的表达没有显著影响,其具体机制作用还需深入研究。

肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建黑素皮质素受体-4(MC4R)重组腺病毒表达载体,为肥胖症的基因治疗研究奠定基础。方法 PCR扩增犬MC4R目的基因后与T载体连接,双酶切鉴定正确的T-A载体获得具有黏性末端的MC4R目的基因;将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建穿梭载体pShuttle-CMV/MC4R;PmeⅠ单酶切pshuttle-CMV/犬MC4R后,转化到含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体pAdeasy-1/pshuttle-CMV/MC4R;筛选阳性克隆子;PacⅠ酶切鉴定。结果线性化的pShuttle-CMV/MC4R转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,16 h后获得阳性克隆子,经PacⅠ酶切鉴定出一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,通过BglⅡ、XhoⅠ双酶切切下约1000 bp的片段,含MC4R目的基因的重组腺病毒载体构建成功。结论细菌内同源重组法可高效、快捷的制备含犬MC4R的重组腺病毒载体;该载体为人类肥胖症的基因治疗研究奠定了基础。

三个绵羊群体MC4R基因多态性及生物信息学分析

旨在探讨绵羊黑素皮质素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)的分子机理,采用PCR-SSCP方法对3个绵羊群体(甘肃肉用绵羊新品种群、小尾寒羊和湖羊)的MC4R基因外显子进行多态性检测和生物信息学分析。结果表明,3个绵羊群体均存在3种基因型AA型、AB型和BB型,优势基因型为BB,其中优势等位基因为B;测序结果表明,野生型BB型和突变型AB型相比,AB型个体在该基因编码区第511位点发生G→A突变,第495位发生C→T突变;AA型个体在该基因编码区第511位点发生G→A突变,出现AA的纯合,第495位发生C→T突变,出现CC纯合;3个绵羊群体中小尾寒羊的多态信息含量属于中度多态(0.25<PIC<0.50),甘肃肉用绵羊新品种群羊和湖羊属于低度多态(PIC<0.25);χ2适合性检验表明除湖羊之外,其余2个绵羊品种均处于Hardy-Weinberg平衡状态。生物信息学分析发现MC4R氨基酸序列有明显的疏水性区域,有7个跨膜螺旋区及信号肽,其编码蛋白主要的二级结构元件是α螺旋和无规则卷曲;同源性比对发现绵羊MC4R基因与山羊、牛、野猪、人类及大猩猩的相似度分别为97%、94%、81%、83%及83%,说明MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。

MC4R基因研究进展

黑素皮质素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质,为黑素皮质素受体家族5个亚型(MC1-5R)之一。在哺乳动物中,MC4R具有介导瘦蛋白(leptin)的功能,是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子,可与其内源性配体黑素皮质素激素(melanocortin,MC)或刺鼠色蛋白(agouti protein,agouti蛋白)和agouti相关蛋白(agouti related protein,AGRP)相结合,从而在控制食欲和体重稳态中起关键作用。因此,MC4R在人类肥胖研究中作为重要的调节因子倍受关注。最近有研究表明:MC4R的1232位点的G→A的突变与绵羊背膘厚度间存在关联,AG和AA型较GG型具有较高的背膘厚度。

普洱茶提取物对单纯性肥胖大鼠MC4R基因表达的影响

为观察普洱茶提取物对高脂饮食诱导肥胖大鼠脂肪组织中黑皮素受体-4(MC4R)基因表达的影响,进一步探讨普洱茶抗肥胖的相关机制,本试验将大鼠随机分为正常对照组、高脂饲料组、高脂饲料+普洱茶提取物干预组,构建单纯性肥胖模型。每周测量大鼠体重,3个月试验结束后测量大鼠终末体重、脂肪组织重量,检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)等血脂水平。提取大鼠附睾脂肪组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western blot)检测肥胖相关基因MC4R mRNA和蛋白的表达水平。结果显示:普洱茶能显著减轻高脂饮食大鼠体重和脂肪组织重量,降低体脂比,并降低各项血脂水平;普洱茶提取物能显著上调MC4R基因和蛋白的表达。这表明普洱茶提取物具有减肥降脂作用,其分子机制可能与上调肥胖重要调节因子MC4R有关。

非典型抗精神病药物导致的代谢紊乱

非典型抗精神病药物(AAPD)是目前临床中治疗精神疾病的主要药物,但是,AAPD引起的体重增加(AIWG)已经成为精神疾病治疗过程中所要面临的严峻问题之一。AIWG的分子机制涉及5-羟色胺受体、组胺受体、瘦素和黑素皮质素-4受体等相关靶点或通路,提示导致AIWG的原因可能是多方面的。通过对防治AIWG的药物及其相关药理机制进行介绍,可能为AAPD的临床应用提供理论基础。

奶牛MC4R基因真核表达载体的构建及其表达定位

奶牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因作为G蛋白偶联受体,是关系经济性状的重要候选基因。本研究从牛基因组中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pc DNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体,将载体瞬时转染到L02肝脏细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜观察荧光活性,结果发现克隆的MC4R基因序列长度大约1 000 bp,成功构建真核表达载体MC4R-3.1,将载体转染肝脏细胞后Western blot检测蛋白表达,经过激光共聚焦观察荧光后发现MC4R蛋白的绿色荧光在细胞膜上有正常表达,可为进一步研究MC4R受体基因功能提供参考。

猪MC4R基因Asp298Asn位点多态性及其与生长性状的关联

采用PCR-RFLPs方法对杜洛克、长白、大白3个品种共569头种猪的黑素皮质素受体-4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因的Asp298Asn位点多态性进行检测,分析了不同基因型对7个生长性状的影响。结果表明：3个品种均以GA基因型频率最高,大白猪等位基因A的频率高于G,杜洛克和长白则相反;在杜洛克中,GA基因型个体达100 kg体重日龄最短（P〈0.05）,50～100 kg阶段的日增重最大（P〈0.05）,100 kg活体背膘厚最薄（P〈0.05）;在大白猪中,AA基因型个体达50 kg体重日龄、达100 kg体重日龄最短（P〈0.01）,50～100 kg、30～100 kg阶段的日增重提高（P〈0.01）,100 kg活体背膘厚最薄（P〈0.05）;长白猪不同基因型在所有性状上的差异均不显著（P〉0.05）。研究结果进一步证实MC4R基因Asp298Asn位点确实与某些品种猪的生长性状显著关联,但在不同品种中,该位点的具体效应可能有所不同。