黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上,得到pSES-HUS-MCHR2siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株,RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响.结果:成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体.MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达.结论:构建的Adeasy-MCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达,为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具.

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测MCHR1的表达。结果成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础。

黑色素浓集激素:一种与体重调节有关的下丘脑肽

黑色素浓集激素(MCH)是一种含有19个氨基酸的神经肽,主要存在于下丘脑侧面。目前的研究证实,它是机体能量内稳系统中一种关键的调节因子,可能与肥胖综合征的发病有关,阻断其信号的药物将是治疗肥胖的有效药物。

佛罗里达红罗非鱼黑色素浓集激素1基因的克隆与表达分析

采用同源克隆技术获得了佛罗里达红罗非鱼(Oreochromis sp.)前原黑色素浓集激素1(prepro-melanin concentrating hormone 1,pmch1)基因c DNA全长序列,将其命名为flpmch1;并通过实时荧光定量PCR(q RTPCR)分析天生黑斑佛罗里达红罗非鱼组织表达谱和低温胁迫后其各组织表达差异。结果表明,flpmch1 c DNA序列全长629 bp,开放阅读框411 bp,编码136个氨基酸,存在12个潜在磷酸化位点和1个长度为199 bp的Cp G岛。Flpmch1与24个物种Pmch1氨基酸序列比对结果表明,Flpmch1与尼罗罗非鱼(O.niloticus)、奥利亚罗非鱼(O.aureus)、莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)的Pmch1相似性最高。系统进化树分析显示硬骨鱼纲Pmch聚成一个大支,Flpmch1与尼罗罗非鱼Pmch1进化地位最接近。组织表达谱分析显示,flpmch1 m RNA在多个组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,且粉白色皮肤中的表达量显著高于黑色皮肤(P<0.01)。低温胁迫后flpmch1 m RNA各组织表达量较对照组均呈下调表达。推断flpmch1可能参与了佛罗里达红罗非鱼天生黑斑的形成和过冬黑化过程。

黑色素浓集激素受体与肥胖

黒色素浓集激素(melanin-concentratinghormone,MCH)是一种含有19个氨基酸的神经肽,主要存在于下丘脑。它有MCHR1和MCHR2两种G蛋白偶联受体,两种受体的分布及在大脑中的表达基本相似,但MCHR2不存在于啮齿动物中。MCHR1可与多种G蛋白偶联而MCHR2主要与Gq蛋白偶联。MCH与受体结合后将介导不同的信号通路。MCH是机体能量稳态系统中一种关键调节因子,与肥胖发生有关。

黑色素浓集激素及其受体与肥胖的相关关系

黑色素浓集激素(MCH)是一种含19个氨基酸的神经肽,由下丘脑外侧区释放,其神经纤维广泛分布于大脑各个区域,在摄食行为、能量平衡及体重的调节中起重要作用,并与肥胖的发生、发展密切相关。近年来研究发现,MCH受体有2个亚型,即MCH-1R和MCH-2R,均属于G蛋白偶联受体家族,可激活多个第二信使通路。对MCH及其受体与肥胖关系的研究可能为控制肥胖提供新的治疗策略。

黑色素浓集激素水平与缺血性脑卒中后睡眠、记忆功能障碍及预后的关系研究

目的:探讨缺血性脑卒中(CIS)患者脑脊液和血清黑色素浓集激素(MCH)水平与睡眠障碍、记忆功能障碍及预后的关系。方法:选择河南省人民医院神经内科自2021年6月至2022年1月收治的老年CIS患者100例(CIS组)和同期本院体检中心的老年体检者50例(对照组)。采用ELISA法测定2组受试者脑脊液和血清MCH水平,采用多导睡眠监测仪和匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)量表评估CIS患者的睡眠质量,采用Rivermead行为记忆测验第2版(RBMT-Ⅱ)评估患者的记忆功能,出院后3个月采用改良Rankin量表(mRS)评估患者的预后,比较2组受试者临床资料、MCH水平以及不同睡眠障碍程度、记忆功能、预后CIS组患者MCH水平的差异,相关性分析CIS患者MCH水平与睡眠参数、RBMT-Ⅱ评分的相关性。结果:与对照组比较,CIS组患者合并高血压者所占比例较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组[(42.39±16.11)pg/mL]比较,CIS组患者血清MCH水平[(36.89±15.19)pg/mL]较低,差异有统计学意义(P<0.05)。与非睡眠障碍组相比,轻度睡眠障碍组和重度睡眠障碍组患者脑脊液MCH水平均明显降低,且重度睡眠障碍组患者脑脊液MCH水平低于轻度睡眠障碍组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与非睡眠障碍组相比,重度睡眠障碍组患者血清MCH水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,CIS患者脑脊液MCH水平与PSQI评分、睡眠潜伏期、觉醒次数均呈负相关关系(P<0.05),与快速眼球运动期睡眠所占总睡眠时间的百分比(REM%)呈正相关关系(P<0.05);CIS患者血清MCH水平与PSQI评分、觉醒次数呈负相关关系(P<0.05)。与记忆功能正常组比较,记忆功能障碍组患者脑脊液和血清MCH水平均较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,CIS患者的RBMT-Ⅱ评分与脑脊液MCH水平呈正相关关系(P<0.05)。与预后良好组比较,预后不良组患者脑脊液和血清MCH水平均较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:CIS患者的血清MCH水平显著降低,与CIS后睡眠障碍、记忆功能障碍的发生密切相关并进而影响预后。

MCHR2在豚鼠大脑组织内的表达

肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的.自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2(melanin-concentrating hormonereceptor-2,MCHR2)与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主要瓶颈是没找到合适的动物模型.本课题通过对多种动物的筛选,首次发现豚鼠大脑中存在MCHR2的高度表达,并运用RT-PCR、Northern印迹和Western印迹等方法进行了验证.这一结果为将豚鼠作为MCHR2功能研究的动物模型提供了实验依据.

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。

酸枣仁中斯皮诺素对睡眠剥夺大鼠下丘脑MCH、Orexin-A表达的影响

目的探讨酸枣仁中斯皮诺素对睡眠剥夺大鼠下丘脑黑色素浓集激素(MCH)、食欲素-A(Orexin-A)表达的影响。方法 120只大鼠随机分为对照组、模型组、地西泮组、斯皮诺素组,每组30只,对照组大鼠正常环境下常规饲养,模型组大鼠灌胃给予生理盐水,地西泮组大鼠灌胃给予地西泮(0.8 mg/kg),斯皮诺素组大鼠灌胃给予斯皮诺素(15 mg/kg),剂量10 mL/kg,连续2 d。然后,免疫组化染色法检测大鼠下丘脑MCH、Orexin-A阳性表达,RT-PCR法检测两者mRNA表达,ELISA法检测两者水平。结果与模型组比较,斯皮诺素组MCH阳性表达光密度、面密度、阳性细胞数、mRNA表达、水平显著升高(P<0.01),而Orexin上述指标显著降低(P<0.01)。结论酸枣仁中斯皮诺素可改善睡眠剥夺大鼠睡眠,其机制可能与上调下丘脑MCH表达、下调Orexin表达有关。

胆囊收缩素参与脑-肠轴调控机制的研究进展

迷走传入神经元接受脑-肠肽的信号刺激并传递至下丘脑，对摄食行为进行调节。胆囊收缩素（CCK）作为一种重要的胃肠激素，在脑-肠轴调控机制中起关键作用，它能够兴奋迷走传入神经元，调节某些G蛋白偶联受体的兴奋性以及其他肽类神经递质的释放。本文就关于胃肠激素参与脑-肠轴调控机制的进展，特别是CCK在迷走传入神经途径中的“枢纽”作用作一综述。

MCHR1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建有效针对小鼠黑色素浓集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,MCHR1)的shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体。方法设计合成3条小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1条无同源性的shRNA序列作为阴性对照,与质粒重组构建sh-MCHR1干扰载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定;脂质体法转染小鼠3T3-L1细胞后观察MCHR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果经菌液PCR及DNA测序鉴定表明各shRNA载体构建成功;转染3T3-L1细胞后,与空载体组相比,阴性对照组MCHR1 mRNA和蛋白的表达均无明显差异,但实验组3种干扰载体均能显著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且3种载体的抑制程度有一定的差异,以sh-MCHR1-1载体沉默效果最佳。结论 sh-MCHR1干扰载体构建成功,为进一步探究MCHR1与肥胖症之间的关系奠定了实验基础。

SNAP94847经腹侧被盖区至迷走神经背侧运动核对焦虑大鼠胃黏膜损伤作用研究

目的:探究黑色素浓集激素(MCH)受体1(MCHR1)拮抗剂SNAP94847能否作用于腹侧被盖区至迷走神经背侧运动核(VTA-DMV)神经通路,进而参与调控大鼠应激性焦虑所致胃黏膜损伤及其潜在机制。方法:采用荧光金逆行追踪结合免疫荧光组织化学法检测VTA-DMV的MCHR神经通路(n=10);采用单细胞外放电记录法检测大鼠VTA微量注射MCH或SNAP94847对多巴胺(DA)神经元放电活动的影响(n=30);18只大鼠随机分为正常+生理盐水(NS)组、焦虑+NS组和焦虑+SNAP94847组,观察VTA微量注射SNAP94847后大鼠行为学变化、胃黏膜炎症损伤及相关炎症指标的变化(n=6);24只焦虑模型大鼠随机分为假损毁+NS组、假损毁+SNAP94847组、电损毁+NS组及电损毁+SNAP94847组,观察电损毁DMV后VTA微量注射SNAP94847对胃黏膜炎症损伤相关炎症指标的影响(n=6)。结果:逆行追踪结合荧光免疫组织化学染色结果显示,VTA可见部分MCHR和荧光金双重标记神经元;MCH可改变大鼠VTA内DA神经元放电活动,且对焦虑模型大鼠的影响更显著(P<0.05);高架十字迷宫实验中,与对照组相比,焦虑+SNAP94847组进入闭合臂次数和时间百分比显著增加(P<0.05);焦虑模型大鼠炎症标志物过氧化氢酶(CAT)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量显著降低(P<0.05),髓过氧化物酶(MPO)活性及丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量显著升高(P<0.05),VTA微量注射SNAP94847可显著减轻焦虑模型大鼠胃黏膜炎症损伤(P<0.05);与假损毁+SNAP94847组相比,电损毁+SNAP94847组焦虑模型大鼠CAT活性和GSH-Px含量显著降低(P<0.05),而MPO活性及MDA、TNF-α和IL-6含量显著升高(P<0.05)。结论:VTA-DMV的MCHR信号通路可能参与应激所致焦虑大鼠胃黏膜炎症损伤及焦虑样行为的调控。

Nesfatin-1及MCH对大鼠胃酸分泌和胃运动的影响

目的:本实验主要探究nesfatin-1对胃运动和胃酸分泌的影响,以及弓状核(ARC)-下丘脑外侧区(LHA)nesfatin-1神经通路在该过程中的作用。方法:采用逆行追踪和免疫组织化学染色实验观察ARC-LHA nesfatin-1神经通路的构成;在体胃运动实验观察nesfatin-1对胃运动的影响以电刺激ARC对胃运动的影响;采用幽门结扎法测量胃液和胃酸分泌量。结果:LHA微量注射nesfatin-1抑制胃运动和胃酸分泌,但是预先注射黑色素浓集激素(MCH)受体拮抗剂PMC-3881-PI减弱nesfatin-1对胃运动和胃酸分泌的抑制作用。电刺激ARC后,胃收缩幅度和频率显著增强,胃酸分泌明显增多。nesfatin-1抗体或PMC-3881-PI对电刺激ARC诱导的胃运动没有显著影响,但是能够改变电刺激ARC诱导的胃酸分泌。结论:ARC-LHA间nesfafin-1通路可调控大鼠胃运动和胃酸分泌,并且黑色素浓集激素也参与调节该过程。