黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上,得到pSES-HUS-MCHR2siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株,RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响.结果:成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体.MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达.结论:构建的Adeasy-MCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达,为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具.

MCHR2在豚鼠大脑组织内的表达

肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的.自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2(melanin-concentrating hormonereceptor-2,MCHR2)与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主要瓶颈是没找到合适的动物模型.本课题通过对多种动物的筛选,首次发现豚鼠大脑中存在MCHR2的高度表达,并运用RT-PCR、Northern印迹和Western印迹等方法进行了验证.这一结果为将豚鼠作为MCHR2功能研究的动物模型提供了实验依据.

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。