人黑色素瘤特异性抗原基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的:克隆及表达特异性抗原(PRAME)基因的cDNA片段。方法:从人急性髓细胞白血病细胞系HL60提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)从中扩增出PRAME基因cDNA片段。将PRAME基因cDNA片段插入载体pGEM T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体pGEX4T2中,构建高效表达克隆,并转化大肠杆菌进行表达。结果:1mmol/L异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h,PRAME蛋白表达即达高峰。结论:PRAME基因在极少数正常组织中低表达,而在白血病患者高表达,并编码被自体细胞毒T淋巴细胞识别的抗原,所以该基因有望成为肿瘤免疫治疗的新成员。

黑色素瘤特异性抗原基因与血液恶性肿瘤

黑色素瘤特异性抗原(Preferentiallyexpressedantigenofmelanoma,PRAME),是第一个被分离出的人类黑色素瘤抗原,也表达于某些血液恶性肿瘤,包括急性髓性白血病(Acutemyeloidleukemia,AML)、多发性骨髓瘤等。近来的研究证实PRAME基因是对白血病微小残留病(Minimalresidualdisease,MDR)监测的一个有效标志,并且PRAME作为特异性靶抗原用于血液恶性肿瘤免疫治疗是目前研究的热点。现就黑色素瘤特异性抗原和血液恶性肿瘤之间的关系以及它在免疫治疗中的作用做一综述。

急性白血病儿童黑色素瘤特异性抗原基因表达的意义

目的检测黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因在急性白血病儿童中的表达,并探讨其临床意义。方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测72例急性白血病(AL)患儿及20例对照者骨髓或外周血中PRAME基因mRNA的表达,并对PRAME基因mRNA表达阳性者进行动态检测。结果急性白血病患儿确诊时PRAME基因的阳性表达率为40.28%,其中45例急性淋巴细胞白血病患儿阳性表达率为40.0%,27例急性髓细胞白血病患儿中PRAME基因的阳性表达率为40.74%,两者之间无显著差异(P>0.05);而对照组均为阴性表达。PRAME基因的表达在白血病缓解期明显降低,当病情复发时PRAME基因的表达再次上升。结论PRAME基因在儿童AL中有较高水平表达,其动态变化与预后密切相关,可作为儿童AL微小残留病变的一个监测指标,对判断预后、指导治疗有重要意义。

黑色素瘤特异性抗原基因在儿童急性白血病中的表达及初步应用

目的探讨急性白血病(AL)儿童骨髓及外周血单个核细胞(MNC)中黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因表达情况,以及用于微小残留病监测的临床意义。方法釆用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测31例初发、6例复发、10例完全缓解期AL儿童骨髓及外周血PRAME mRNA的表达情况,同时检测10例非血液系统恶性疾病患儿骨髓、5例正常成人外周血中PRAME mRNA的表达情况,分析该基因与疗效、预后之间的关系。结果 37例初发及复发AL病例中15例PRAME mRNA表达阳性(40.5%),其中在急性淋巴细胞白血病(ALL)组、急性髓系白血病(ANLL)组的阳性率分别为37.9%、50.0%,两组比较差异无显著性(P>0.05)。在初发组及复发组的表达率分别为38.7%、50.0%,两组比较差异无显著性(P>0.05)。10例完全缓解期及15例对照组病例中PRAME mRNA表达均阴性。PRAME基因表达阳性的患儿完全缓解率(CR)显著低于表达阴性的患儿(CR率分别为60.0%,90.99%,P=0.042)。随访1例初诊PRAME基因表达阳性的ALL患儿,经化学治疗达完全缓解后PRAME基因表达转阴。结论 PRAME基因可在AL患儿中呈阳性表达,并可随疾病的缓解情况逐渐降低或转阴。因此,PRAME基因作为儿童AL的一个重要基因标记物,动态监测其表达水平在评估疗效、判断预后、预测复发方面有一定的意义。

急性白血病患儿黑色素瘤特异性抗原基因的表达及与WT1基因的比较

目的探讨急性白血病(AL)患儿骨髓及外周血单个核细胞(MNC)中黑色素瘤特异性抗原(PRAME)基因表达及用于微小残留病监测的可行性。方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测51例AL患儿[未缓解组40例,其中ALL29例,急性髓细胞性白血病(AML)11例;缓解组11例]PRAMEmRNA的表达情况。同期与WT1mRNA表达进行比较。设立20例非恶性血液系统疾病患儿骨髓标本、5例健康成人外周血标本作为阴性对照。结果未缓解组17例(42.5%)可检测出不同水平PRAME基因表达,其中ALL组与AML组的表达率(41.4%vs45.5%)、表达水平[(1.0966±0.4033)vs(1.0641±0.4274)]比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。缓解组与对照组均未检测出PRAME基因表达。6例初发患儿外周血MNC中PRAMEmRNA表达水平(0.5531±0.4786)与骨髓中表达水平(0.5755±0.6853)一致,差异无统计学意义(P>0.05)。34例初发患儿总完全缓解(CR)率为88.2%(30例),其中初诊时PRAME、WT1基因表达均为阳性和均为阴性组CR率(62.5%vs100%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。短期随访(1～13个月)2例WT1基因阳性和2例PRAME、WT1均表达阳性的患儿,2例化疗达CR时,PRAME、WT1基因表达水平均下降,并逐渐转阴。另外2例第1疗程化疗结束未达临床缓解,PRAME、WT1基因持续高水平表达,放弃治疗。结论应用RT-PCR方法跟踪监测PRAME基因表达,可在一定程度上了解体内白血病细胞负荷,有助于指导治疗,可用于微小残留病的监测。

肿瘤特异性凋亡基因诱导人黑色素瘤细胞凋亡机制的研究

目的研究肿瘤特异性凋亡基因(Apoptin gene)在诱导人黑色素瘤细胞A375发生凋亡时,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在细胞发生凋亡中的作用。方法用含有肿瘤特异性凋亡(Apoptin)基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375;采用流式细胞仪、免疫印迹法(W estern b lot)、台盼蓝染色法及RT-PCR等方法研究其在不同时间条件下对人黑色素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果Apoptin基因瞬间转染的人黑色素瘤A375细胞出现明显的细胞凋亡,凋亡细胞的数量随Apoptin转染时间延长而增多,磷酸化型JNK蛋白在转染Apoptin 24 h开始表达,48h和72h过表达,而非磷酸化型JNK蛋白表达无明显变化。结论Apoptin基因具有诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡的作用,JNK信号通路的激活可能在Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用。

黑色素瘤特异性抗原基因定量检测在急性髓系白血病及微小残留病监测中的应用

目的探讨黑色素瘤特异性抗原（PRAME）mRNA在初诊急性髓系白血病（AML）患者中的表达，评估其在微小残留病（MRD）监测中的作用。方法收集63例初诊AML患者骨髓标本，并在28个月内追踪了11例患者的34份样本，用Taqman探针的荧光定量PCR技术检测PRAME mRNA的表达。结果初诊患者中PRAME基因表达阳性率52．4％（33／63），不同类型的AML中PRAME基因表达以M，最高；治疗缓解后PRAME基因转阴，形态学复发前数月可检测到PRAME mRNA的升高。结论PRAME mRNA在AML中高表达，可作为一个广谱的白血病标志物，用于MRD的监测。

肿瘤特异性凋亡基因对人黑色素瘤细胞A375凋亡诱导作用

为观察肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)对人黑色素瘤细胞A375的凋亡诱导作用,用含有凋亡基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375,采用台盼蓝染色法、RT-PCR及DNA凝胶电泳等方法研究其在不同时间条件下对人黑色素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果表明,凋亡基因瞬间转染的人黑色素瘤细胞A375可出现明显的细胞凋亡;而且凋亡细胞的数量与转染时间有关。结论:凋亡基因具有诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡的作用。

黑色素瘤特异性抗原在肿瘤中的表达及其对免疫治疗的作用

黑色素瘤特异性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME）是肿瘤睾丸抗原家族的一员,最初在黑色素瘤患者中被发现,是一种能够被细胞毒性T淋巴细胞特异性识别并引起肿瘤溶解的表面抗原[1],其表达可受调控区域的甲基化调节[2]。

黑色素瘤抗原-A1 -A3的表达与喉癌临床特征相关性的研究

目的了解不同分期喉癌患者手术前后的肿瘤-睾丸抗原(CTA)家族中的黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)和黑色素瘤抗原-A3(MAGE-A3)的血清学浓度变化情况,筛选喉癌诊断的CTA血清标志物。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测25例喉癌患者手术前、手术后血清中的MAGE-A1和MAGE-A3水平,并进一步检测46例喉癌患者手术前组、33例喉癌患者手术后组和20名健康人血清中的5种CTA。结果 ELISA法检测25例喉癌患者手术前、手术后血清中MAGE-A1和MAGE-A3浓度差异有统计学意义(P<0.05)。在46例喉癌患者手术前组、33例喉癌患者手术后组和20名健康人中,MAGE-A1和MAGE-A3手术前组和健康人组血清的浓度差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MAGE-A1和MAGE-A3有可能成为喉癌诊断和预测复发的CTA血清标志物。

脑胶质瘤患者血清黑色素瘤相关抗原-A3特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫反应水平及临床意义

目的探讨脑胶质瘤组织中黑色素瘤相关抗原-A3(MAGE-A3)蛋白表达和甲基化状态,血清中特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答及临床意义。方法采用蛋白质印迹(Western blot)法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)技术检测56例脑胶质瘤组织和15例正常脑组织中MAGE-A3蛋白表达和基因甲基化状态,采用Gultured酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测患者外周血单个核细胞(PBMC)中MAGE-A3特异性CTL免疫反应,并明确二者之间的关系,以及与患者临床特征的关系。结果56例脑胶质瘤组织中MAGE-A3蛋白的表达量为(2.26±1.09),明显高于15例正常脑组织中的(0.44±0.18)(P﹤0.01)。脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化率为55.36%(31/56),明显低于正常脑组织的100%(15/15)(P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性率为33.93%(19/56),平均反应强度为(2301.70±560.33)SFC/106 PBMC。同一患者脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子甲基化状态与MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.679,P﹤0.01)。同一患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫应答阳性与组织中MAGE-A3蛋白高表达结果一致性一般(Kappa=0.464,P﹤0.01)。脑胶质瘤患者血清中MAGE-A3特异性CTL免疫反应强度与组织中MAGE-A3蛋白表达量呈正相关(r=0.788,P﹤0.01)。不同肿瘤大小及临床分期的脑胶质瘤患者血清MAGE-A3特异性CTL免疫反应频率比较,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论脑胶质瘤组织中MAGE-A3基因启动子区DNA去甲基化导致MAGE-A3蛋白表达量升高,进而刺激机体产生MAGE-A3特异性CTL免疫应答反应,参与肿瘤生长和恶性进展。

黑色素瘤抗原基因与肿瘤免疫治疗

黑色素瘤抗原基因 (MAGE)表达产物是一种肿瘤特异性抗原 ,只在肿瘤、睾丸和胎盘组织中表达 ,在其他正常组织不表达 ,其发现有助于肿瘤的早期诊断和微小转移灶的检测。细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)通过识别由MAGE基因编码的抗原而杀伤肿瘤细胞。MAGE抗原为基础的免疫治疗在黑色素瘤和某些实体瘤的治疗中取得良好疗效 。

黑色素瘤特异性抗原在胃癌组织中的表达及对胃癌肝转移和预后的影响

目的 检测胃癌组织中黑色素瘤特异性抗原(PRAME)的表达,分析其对胃癌肝转移的预测价值及预后的影响。方法 2016年1月至2018年10月在我院接受治疗的胃癌无肝转移患者142例,分析影响胃癌肝转移的独立危险因素,检测PRAME高表达预测胃癌肝转移的临床价值,比较PRAME高表达胃癌肝转移者与PRAME低表达胃癌肝转移者术后3年生存率。结果 术后3年发生肝转移34例(23.9%),无肝转移108例。PRAME在胃癌组织中低表达65例,高表达77例。多因素Logistic回归分析显示淋巴结转移、血管侵犯、CA72-4>6.7μg/L和PRAME高表达均为影响胃癌肝转移的独立危险因素。PRAME高表达预测肝转移的曲线下面积为0.896,敏感度为0.836,特异度为0.735,对肝转移具有一定临床预测价值(P<0.05)。肝转移PRAME高表达组生存率为18.5%,低于肝转移PRAME低表达组50.0%(P<0.05)。结论 胃癌组织中PRAME高表达为肝转移的独立危险因素,对肝转移有一定预测价值并影响其预后。

应用实时荧光PCR法建立献血者血小板特异性抗原HPA-1~6/10/15/21基因分型资料库

目的研究中山地区单采血小板献血者人类血小板特异性抗原HPA-1~6/10/15/21共9对抗原基因多态性区域分布特点,建立中山地区血小板献血者HPA基因分型资料库。方法用实时荧光定量PCR-TaqMan探针法对中山地区192名单采血小板献血者进行HPA-1~6/10/15/21基因分型,计算基因型频率、基因频率。结果HPA-1~6/10/15/21中,HPA-4、10系统呈单特异性,只检测出aa基因型,未检出等位基因HPA-b;HPA-1、2、5、6、21基因型以aa占绝大多数;HPA-3、15具有较高的杂合度,基因型HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb频率分别是0.3073、0.4948、0.1979;基因型HPA-15aa、HPA-15ab、HPA-15bb频率分别是0.2708、0.5052、0.2240。结论中山地区血小板献血者HPA-1~6/10/15/21基因与其他地区的同类资料相比显示出地域差异性,建立HPA基因分型资料库有助于解决血小板不配合输注产生同种免疫的问题。

黑色素瘤相关抗原MAGE-A2:肿瘤免疫治疗新靶点

癌-睾丸抗原（Cancer-Testis Antigen,CTA）是一类广谱的肿瘤特异性抗原。CTA能在多种肿瘤组织中广泛表达,而在正常组织（除胎盘和睾丸）中几乎不表达,并且在一些肿瘤患者体内可引起免疫反应。

多房棘球蚴病特异性诊断抗原Em18的基因克隆、表达和血清学评价

目的 克隆从我国四川省分离的多房棘球绦虫Em18抗原基因片段 ,表达重组抗原 ,用于多房棘球蚴病(AE)的诊断 ,并用患者血清对其诊断价值进行评价。 方法 PCR扩增目的基因片段与质粒载体 pET2 8a (+ )连接构建表达质粒 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 )菌株表达重组蛋白 ,用镍 次氮基三乙酸琼脂糖树脂 (NI NTAagarose)亲和层析纯化重组抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)评价重组抗原的血清学诊断效果。 结果 获得两个高效表达克隆ReEm18 1和ReEm 18 2。其中ReEm18 1与预期序列一致 ,ReEm18 2为同一序列 ,但有 2 7bp的核苷酸缺失。两个克隆表达的融合蛋白相对分子质量 (Mr)分别为 2 80 0 0和 2 60 0 0。对 10 1例AE、 47例细粒棘球蚴病、3 0例囊尾蚴病、 10例肝癌、 9例血吸虫病和 40名健康人共 2 3 7份血清进行ELISA检测 ,结果显示 ,ReEm18 1和ReEm 18 2重组抗原对AE血清诊断的敏感性为 86 1%和 90 1%、特异性为 93 4%和 94 1%、阳性预期值为 90 6%和 91 9%、阴性预期值为 90 1%和 92 8%、诊断效率分别为 90 3 %和 92 4% ;对 5 8例AE患者肝脏病灶大小与重组抗原检测血清平均吸光度 (A )的相关性比较分析结果表明 ,抗体反应水平在病程早期有较好的相关性。

山东汉族人群血小板特异性抗原基因的多态性研究

目的 研究山东汉族人群血小板特异性抗原（HPA）1～5和15系统基因多态性分布特点。方法 采用PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）技术对234例无血缘关系，汉族，血小板志愿捐献者进行HPA-1～5和HPA-15系统基因分型，计算等位基因频率、基因型频率并与其他种族、地区人群相关资料比较。结果 等位基因频率由高到低依次为HPA-4a、-1a、-5a、-2a、-3a、-15a、-15b、-3b、-2b、-5b、-1b，未检到HPA-4b。基因型频率由高到低依次为HPA-4a4a、-1a1a、-5a5a、-2a2a、-15a15b、-3a3b、-3a3a、-15a15a、-363b、-15b15b、-2a2b、-5a5b、-1a1b，未检到HPA-1b1b、-5b5b和HPA-2b2b。与报道的东方人群比较，有显著性差异的系统有HPA-2、-3,-5（P〈0．005）；与西方人群比较，HPA-1、-2、-3、-5系统有显著性差异（P〈0．005），HPA-4无种族间显著性差异。HPA-15系统的基因分布与越南、德国、奥地利人近似，而与印地安人有较大差异（P〈0．005）。结论 HPA存在明显的种族和地域性差异。山东汉族人发生HPA同种免疫的可能风险抗原基因主要有HPA-3a，-3b，-2b，-5b，-1b，其次为HPA-15a、-15b。

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

【目的】克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子。【方法】从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoRⅠ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定。【结果】首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础。【结论】分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一。

MHC基因转染的和/或感染新城病毒的瘤苗可有效抵抗黑色素瘤的肺转移

免疫治疗是肿瘤患者手术后预防肿瘤转移的较有效的手段之一．其中通过增强肿瘤的免疫原性，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫来选择杀伤肿瘤细胞是免疫治疗的主要机理．本文通过黑色素瘤细胞经MHC Ⅰ类基因转染及合用病毒感染后改变肿瘤细胞的免疫原性的方法制成瘤苗，来研究其抗肿瘤转移的免疫治疗效果。