紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响

目的探讨紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响。方法建立A375细胞与HaCaT细胞的共培养细胞体系,实验分为对照组(等体积培养液),紫铆花素低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组,0.5,1.0,5.0μg/L)。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测细胞的周期分布和线粒体膜电位;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测干细胞因子(SCF)和其受体c-Kit,以及小眼畸形相关转录因子(MITF)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞酪氨酸酶相关蛋白1,2(TRP-1,TRP-2)及SCF,c-Kit,MITF的蛋白表达水平。结果与对照组比较,中、高剂量组细胞的增殖率均显著升高(P<0.01);与对照组比较,各剂量组G0/G1期细胞比例均显著降低,S期和G_(2)/M期细胞比例均显著升高(P<0.01),高线粒体膜电位细胞比例均显著升高(P<0.05或P<0.01),SCF,c-Kit,MITF的mRNA表达水平及SCF,c-Kit,MITF,TRP-1,TRP-2的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论紫铆花素可能通过调节SCF,cKit,MITF的表达而影响A375细胞与HaCaT细胞共培养细胞的增殖、细胞周期和线粒体膜电位等细胞生物学活性。

串内频率对高频纳秒脉冲串诱导A375黑色素瘤细胞电穿孔的影响

高频纳秒脉冲串能有效杀伤肿瘤细胞,但是其杀伤机制,特别是串内频率对诱导电穿孔效应的影响机制仍不清楚。以A375黑色素瘤细胞为研究对象,开展了细胞活性检测、短时/长时荧光染料检测以及细胞微观形态学检测等离体细胞实验,研究高频纳秒脉冲串的串内频率对细胞膜电穿孔的影响机制。细胞活性实验结果表明,高频纳秒脉冲串能有效杀伤肿瘤细胞,串内频率存在使细胞活性显著降低的阈值100k Hz;荧光染料实验结果反映细胞活性降低是由不可逆电穿孔引起,并且存在串内频率对电穿孔的累积效应;扫描电镜实验结果直接验证了高频纳秒脉冲串诱导肿瘤细胞发生了不可逆电穿孔。该实验结果为高频纳秒脉冲串杀伤肿瘤细胞的机制提供了实验依据。

质子辐射对人恶性黑色素瘤A375细胞的DNA损伤影响研究

为研究质子辐射对人恶性黑色素瘤的杀伤效应,本研究利用北京HI-13串列加速器提供的15 MeV质子,以0、1、2、4、8 Gy剂量辐照A375细胞,以细胞克隆术和流式细胞术检测A375细胞的克隆形成率、周期阻滞及凋亡率,用免疫荧光法检测2 Gy辐照后细胞的γH2AX焦点数,并与相同条件下的γ射线辐射对比。结果表明,在1~8 Gy剂量下,随着剂量的增加,A375细胞的存活率下降,在4~8 Gy剂量下,细胞的存活率明显低于γ射线。辐照后12 h,细胞G2/M期阻滞随剂量的增加而增加,质子辐射诱导的周期阻滞强于γ射线;辐照后48 h,γ射线诱导的细胞周期阻滞已基本解除,但质子诱导的细胞周期阻滞除1 Gy外,2~8 Gy均未完全解除。辐射诱导的细胞凋亡随照射剂量的增加而增加,随着时间的延长,凋亡比例有所增加,且质子诱导的细胞凋亡率高于γ射线。辐照2 Gy后,γ射线和质子诱导的γH2AX焦点峰值均在照后1 h出现,质子辐射诱导的γH2AX焦点数和大小均高于γ射线。以上结果表明,质子辐射可有效杀伤恶性黑色素瘤A375细胞,在黑色素瘤治疗中有潜在应用价值。

miR-375表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨miR-375表达对脉络膜黑色素瘤MUM-2B细胞增殖和侵袭的影响。方法:培养MUM-2B细胞,分别转染miR-375模拟物序列(模拟物组)、miR-375抑制物序列(抑制物组)、阴性对照序列(阴性对照组)和不做任何处理(空白组),分别采用qRT-PCR实验、CCK-8实验、细胞凋亡实验、Transwell实验检测细胞中miR-375、细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞迁移和侵袭情况。结果:相比于阴性对照组(1.01±0.10)和空白组(1.03±0.07),模拟物组细胞中miR-375表达量(2.65±0.15)升高,而抑制物组细胞中miR-375表达量(0.28±0.06)降低(P<0.05);与空白组和阴性对照组比较,模拟物组细胞24、48、72和96h时OD值均降低(P<0.05),而抑制物组细胞24、48、72和96h时OD值均升高(P<0.05);与空白组细胞凋亡率(20.54±4.01)%和阴性对照组细胞凋亡率(22.80±4.28)%比较,模拟物组细胞凋亡率(39.11±3.37)%升高(P<0.05),而抑制物组细胞凋亡率(10.13±2.17)%降低(P<0.05);与空白组和阴性对照组比较,模拟物组细胞迁移数和细胞侵袭数均降低(P<0.05),而抑制物组细胞迁移数和细胞侵袭数均升高(P<0.05)。结论:上调MUM-2B细胞中miR-375表达可降低细胞增殖活性,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,下调miR-375表达则发挥相反的作用,表明miR-375可能在脉胳膜黑色素瘤病程中发挥抑癌功能。

三氧化二砷对恶性黑色素瘤A_(375)细胞株凋亡的诱导作用

目的 :研究三氧化二砷 (As2 O3 )对人恶性黑色素瘤A3 75细胞株凋亡的诱导作用。方法 :采用流式细胞术 (FCM )检测不同浓度的三氧化二砷诱导A3 75细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。结果 :As2 O3 浓度分别为 5 μmol/L、10 μmol/L、2 0 μmol/L时 ,A3 75细胞的早期凋亡率分别为 9.75 %、5 0 .9%和 4 3.7% ,晚期凋亡率分别为 2 .10 %、4 .6 1%和 11.2 % ,总凋亡率分别为11.85 %、5 5 .5 1%和 5 4 .9%。结论 :As2 O3 可诱导A3 75细胞早期凋亡和晚期凋亡 ,10 μmol/L和 2 0 μmol/L的As2 O3 可明显增加A3

赤芍总苷对人黑色素瘤细胞株凋亡诱导的作用机制

目的观察赤芍总苷(TPG)对人黑色素瘤A375细胞凋亡的影响并探讨其机制。方法将12.5、25、50、100、200 mg/L TPG分别加入体外培养的黑色素瘤细胞,对照组加等量生理盐水,孵育24、48 h后MTT测定细胞生长抑制率;25 mg/L TPG孵育细胞48 h,收集细胞,FCM测定细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别测定Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA和蛋白的表达水平。结果 TPG抑制A375细胞生长作用明显,25 mg/L TPG孵育黑色素瘤细胞48 h后,细胞凋亡率增高,Caspase-3、Bax、Fas、FasL mRNA和蛋白表达也明显升高,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降,Bcl-2/Bax比值显著降低(均P<0.05)。结论 TPG可诱导黑色素瘤肿瘤细胞凋亡,其机制与上调Caspase-3、Fas和FasL表达水平,下调Bcl-2,降低Bcl-2/Bax比值密切相关。

千金藤素对黑色素瘤干性的影响及机制研究

探讨药物千金藤素对人皮肤黑色素瘤细胞的作用及机制。使用CCK8实验检测人皮肤黑色素瘤细胞系A375对千金藤素的剂量毒性效应,将加入等体积DMSO的A375细胞定义为对照组,A375细胞以梯度浓度和时间的千金藤素处理组设为实验组。成球实验检测肿瘤细胞干细胞成球能力;EdU实验与克隆形成实验检测细胞增殖;蛋白免疫印记实验检测干细胞标记物,以及下游的信号转导机制。结果显示A375细胞随着千金藤素处理剂量与时间的增多增殖受到明显抑制,干性降低,表现为千金藤素处理组EdU标记新生细胞比例降低,肿瘤球形成能力下降,蛋白印迹显示干性标记物表达水平降低。通过对信号转导研究发现,实验组中JAK2/STAT3信号轴被抑制,表明千金藤素可能通过靶向JAK2/STAT3信号轴在人皮肤黑色素瘤中发挥抗癌作用。

冬凌草甲素逆转黑色素瘤细胞顺铂耐药的作用及机制

目的:探讨冬凌草甲素(Ori)逆转人黑色素瘤细胞顺铂(DDP)耐药的作用及其机制。方法:分别将黑色素瘤DDP耐药细胞A375/DDP和M14/DDP分为对照组、2μmol/L Ori组、4 mg/L DDP组和2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组。CCK-8法、Transwell实验、Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式细胞术分别检测各组细胞的增殖活力、侵袭和迁移能力及凋亡水平,透射电子显微镜观察自噬小体,免疫荧光染色法观察微管相关蛋白轻链3(LC3)点状结构,WB法检测A375/DDP细胞自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达。结果:与4 mg/L DDP组相比,2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组细胞增殖活力、迁移和侵袭能力均显著下降(均P<0.01),凋亡水平显著升高(P<0.01)。4 mg/L DDP组细胞中可见大量自噬小体以及LC3点状染色,但2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组仅可见少量。与对照组相比,4 mg/L DDP组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01),p62的蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);与4 mg/L DDP组相比,2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平均显著降低(均P<0.01),p62的表达水平显著升高(P<0.05)。结论:Ori可增加耐药黑色素瘤细胞对DDP的敏感性,此作用可能与其抑制DDP引起的细胞自噬有关。

橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路调控黑色素瘤细胞的恶性生物学行为

目的:探讨橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路抑制黑色素瘤A-375和WM-115细胞恶性生物学行为的分子机制。方法:体外培养黑色素瘤细胞A-375和WM-115,用不同浓度的橙花叔醇处理,采用SRB法和克隆形成实验、FCM术、Transwell实验和细胞划痕实验、DCFH-DA染色法、qPCR和WB法分别检测橙花叔醇对A-375和WM-115细胞的增殖能力、细胞周期和凋亡、迁移能力、活性氧(ROS)水平和Wnt-β-catenin通路及其下游相关基因和相关蛋白表达的影响。利用ULCAN和GEPIA2数据库分析黑色素瘤中Wnt-β-catenin通路的激活与患者预后的关系。结果:与对照组比较,橙花叔醇处理组A-375和WM-115细胞的增殖能力受明显抑制(均P<0.01)、细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.05或P<0.01)、细胞凋亡率增加(均P<0.01)、迁移能力降低(P<0.05或P<0.01)、ROS水平升高(均P<0.01)、Wnt-β-catenin通路被抑制而其下游基因和蛋白表达明显上调(均P<0.01)。数据库数据分析显示,WNT1基因高表达患者OS低于低表达患者(P<0.01)。结论:橙花叔醇通过上调A-375和WM-115细胞中ROS水平影响Wnt-β-catenin通路,从而抑制其恶性生物学行为;Wnt-β-catenin通路可能是黑色素瘤治疗的潜在靶点。

三氧化二砷对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖及新癌基因PPO表达的影响

目的探讨三氧化二砷对人恶性黑素瘤A375细胞株细胞周期、增殖、凋亡及新癌基因PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)表达的影响。方法培养人恶性黑色素瘤A375细胞株,采用MTT法检测三氧化二砷在不同浓度和不同时间下对A375细胞增殖的影响,流式细胞术分析三氧化二砷对细胞周期及凋亡的影响,倒置相差显微镜观察药物处理后对人A375细胞的细胞分化及形态的影响,免疫细胞化学(SP)法检测三氧化二砷对PPO蛋白表达的影响。结果 MTT法证实三氧化二砷在1～10μmol/L浓度范围内对A375细胞有明显的增殖抑制作用,呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。流式细胞术检测发现,随着药物浓度的增加,G0/G1的细胞逐渐减少(P<0.01),S期的比例显著增加,出现S期阻滞。倒置显微镜观察发现细胞出现典型凋亡细胞形态学改变。免疫细胞化学法检测PPO蛋白主要表达于A375细胞胞浆内,染色呈棕黄色。三氧化二砷作用48 h后,随着药物浓度的增加,PPO的染色程度逐渐减弱,差异具有显著性(P<0.01)。结论三氧化二砷能够显著抑制A375细胞株增殖,并诱导凋亡发生,且与三氧化二砷的浓度和作用时间成正相关,其作用机制可能是通过下调新癌基因PPO的表达发挥作用。

吴茱萸碱诱导人黑色素瘤A375-S2细胞的两种死亡机制

目的 研究吴茱萸碱诱导A375 S2细胞死亡机制。方法 MTT法测定吴茱萸碱对A375 S2的细胞毒作用。通过倒置光显微镜 ,荧光染色 ,DNA电泳观察细胞形态学变化。应用流式细胞分析技术研究药物对细胞周期的影响。结果 吴茱萸碱明显抑制A375 S2生长 ,在 2 4h前可诱导A375 S2凋亡 ,亚二倍体峰出现 ,caspase蛋白酶被激活 ,2 4h后启动坏死途径 ,caspase蛋白酶抑制剂不能抑制细胞死亡。结论 吴茱萸碱诱导A375 S2死亡时早期启动了caspase依赖性的非经典凋亡途径 。

芦笋提取液抑制恶性黑色素瘤A_(375)细胞增殖的研究

目的 :探讨芦笋提取液对人恶性黑色素瘤A3 75细胞增殖的抑制作用以及对其凋亡的诱导作用。方法 :用四甲基噻唑氮蓝比色法测定A3 75细胞活力 ;流式细胞术 (FCM)检测A3 75细胞的凋亡诱导及杀伤作用 (P <0 .0 1 )。结果 :芦笋提取液与人恶性黑色素瘤细胞株A3 75细胞生长抑制率之间有明显的浓度依赖关系 ,浓度分别为 2 0 0mg/ml、4 0 0mg/ml、6 0 0mg/ml和80 0mg/ml时 ,A3 75细胞的凋亡率及坏死率分别为 2 .39%、8.85 %、8.71 %、5 .1 6 %和 1 .6 5 %、1 .5 1 %、2 2 .1 0 %、82 .80 %。结论 :芦笋提取液能显著抑制恶性黑色素瘤A3 75细胞的增殖 ,且诱导A3 75细胞总的凋亡率和坏死率与其浓度之间存在着依赖关系。

白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖抑制作用的研究

目的观察白花蛇舌草总黄酮(FOD)对体外培养黑色素瘤A375和B16细胞增殖的影响。方法体外培养黑色素瘤A375和B16细胞,分别使用浓度为6.25、12.5、25、50、100 mg.L-1的FOD作用24、48 h,通过MTT比色法检测细胞生长的抑制作用。结果 12.5 mg.L-1的FOD作用A375细胞48 h后,细胞增殖能力明显受抑制(P<0.05),25 mg.L-1的FOD作用A375细胞24 h后,细胞增殖能力也明显受抑制(P<0.05);25 mg.L-1的FOD作用B16细胞48 h后,细胞增殖活力明显下降(P<0.05),50 mg.L-1的FOD作用B16细胞24 h后,细胞增殖活力也明显降低(P<0.05);分别作用24 h和48 h后,两组随着浓度的升高,不同浓度对细胞的增殖能力抑制差异有统计学意义(P<0.05);随着浓度的增高和作用时间的延长,细胞的增殖能力随着下降。结论 FOD能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖,且具有一定的时-效和量-效关系。

三氧化二砷对恶性黑色素瘤A_(375)细胞的增殖抑制作用

目的 研究三氧化二砷 (As2 O3 )对人恶性黑色素瘤A3 75细胞的增殖抑制作用和抗转移作用 ,为砷及其化合物治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据。方法 用MTT比色法测定A3 75细胞活力 ,用免疫组化方法分析nm2 3蛋白的表达。结果 As2 O3 与人恶性黑色素瘤细胞株A3 75细胞生长抑制率之间有明显的浓度依赖关系 ,IC50 为 13 0 5 μmol·L-1,用药组 (As2 O3 浓度为 2 μmol·L-1)A3 75细胞中有nm2 3抗肿瘤转移基因的表达 ,而对照组则没有。结论 As2 O3 对恶性黑色素瘤A3 75细胞的增殖有浓度依赖性抑制作用 ,并可诱导体内产生nm2 3蛋白 。

全反式维A酸、阿维A和他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及意义

目的探讨全反式维A酸(ATRA)、阿维A及他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及其意义。方法采用体外培养和流式细胞仪检测细胞凋亡(AnnexinV-PI法),SABC免疫细胞化学方法检测细胞Bax/Bcl-2蛋白表达情况。结果浓度均为10-5mol/L的ATRA、阿维A及他扎罗汀能不同程度地诱导了人黑色素瘤细胞A375凋亡,其中阿维A作用最为显著,凋亡率13.42%,明显高于对照组、ATRA及他扎罗汀组(均P<0.05);其次为ATRA(5.03%,明显高于对照组及他扎罗汀组,P<0.05)和他扎罗汀组(凋亡率2.88%)。3种维A酸亦使A375细胞Bax蛋白阳性表达增强而Bcl-2蛋白阳性表达减弱(P<0.05),其中阿维A作用最强,其次为ATRA和他扎罗汀。结论维A酸促进A375细胞凋亡可能部分通过以线粒体为核心的凋亡途径。阿维A可能是防治黑色素瘤的有效药物。

siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞中HOXB7基因的干涉作用研究

目的:观察靶向siRNA抑制恶性黑色素瘤细胞株A375同源盒基因HOXB7表达后,对相应生长因子bFGF表达水平及A375细胞生物学特性的影响。方法:根据HOXB7基因设计3条序列特异性的siRNA(si-HOXB7-1,si-HOXB7-2,si-HOXB7-3),在脂质体Lipofectamine2000的介导下转染A375细胞,采用RT-PCR和FCM法来观察HOXB7及bFGF的基因沉默效应。MTT法检测A375细胞体外增殖活性。结果:3条siRNA均能不同程度地下调A375细胞HOXB7表达水平,第3条序列能更有效地封闭HOXB7基因,而空转组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:靶向HOXB7基因的siRNA可有效沉默HOXB7基因及其调控的基因bFGF的表达,并控制恶性黑色素瘤细胞的生长。

丹参对小鼠黑色素瘤细胞株B16-BL6侵袭和转移能力的影响

目的研究活血化瘀中药丹参对小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6生长、粘附、侵袭、运动、转移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定丹参对B16-BL6细胞增殖能力的影响;采用细胞粘附实验、重组基底膜侵袭实验、趋化性运动能力实验以及小鼠黑色素瘤自发性转移模型,观察丹参对B16-BL6细胞生长、粘附、侵袭、运动及转移能力的影响。结果丹参水提液对B16-BL6细胞的增殖具有双向调节作用;能显著促进B16-BL6细胞与基底膜成分纤维粘连蛋白粘附,显著抑制B16-BL6细胞侵袭基底膜能力及趋化性运动能力;能显著减小肺转移结节体积,但对结节数目没有明显作用。结论丹参提取液能够显著减轻小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6的肺转移程度,可能与其能够抑制B16-BL6细胞对基底膜的侵袭能力以及降低B16-BL6的运动能力有关。

紫菜多酚对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和诱导凋亡的影响及机制探讨

以紫菜为原料,通过乙醇溶剂提取、硅胶柱层析、高效液相制备色谱等步骤,得到紫菜多酚组分C1、C2、D1、D2四个组分.通过MTT法测定组分C1、C2对人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖抑制作用,结果表明:组分C1、C2作用于A375细胞48 h的IC50分别为1.10、1.58 mg·m L-1.采用Annexin V/PI双染测定细胞凋亡情况发现,A375细胞经紫菜多酚组分C1处理后凋亡的细胞比例增加.经组分C1作用的A375细胞中黑色素含量和相对酪氨酸酶活力均得到提高,且与药物浓度呈正相关关系;透射电镜检测A375细胞超微结构的变化发现紫菜多酚组分C1可诱导A375细胞趋向正常分化.

驱虫斑鸠菊提取物抑制恶性黑色素瘤A375细胞增殖的研究

目的探讨驱虫斑鸠菊提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖以及对其酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响。方法四甲基噻唑氮蓝比色法测定对A375细胞抑制作用;显微法观察细胞形态;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量。结果在一定质量浓度范围(1～40mg.L-1)内随着驱虫斑鸠菊提取物质量浓度增加可抑制黑色素瘤细胞的增殖;驱虫斑鸠菊提取物质量浓度小于10mg.L-1,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趋势;大于20mg.L-1时,显示一定的细胞毒性作用。结论驱虫斑鸠菊提取物能显著抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,在一定质量浓度范围内(1～40mg.L-1)有浓度依赖关系(P<0.05)。

人白细胞介素1β通过caspase途径诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡

目的 :对interleukin - 1β(IL - 1β)诱导人黑色素瘤A375 -S2细胞凋亡的信号转导途径进行研究。 方法 :使用倒置显微镜观察细胞形态学变化。通过MTT法测定IL - 1β对A375 -S2细胞的抑制作用以及细胞内半胱氨酸蛋白酶 (caspases)与这种作用的关系。利用乳酸脱氢酶 (LDH)测定法对IL - 1β作用后细胞的损伤情况进行分析。琼脂糖凝胶电泳法检测IL - 1β对细胞DNA降解的影响。 结果 :IL - 1β对A375 -S2细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性 ,在 10 -9mol/L作用 72h时达到 90 %以上。caspase- 1、- 3、- 8、- 9和caspase - 10的抑制剂能够部分抑制IL -1β早期诱导的细胞凋亡。LDH活力测定显示 ,在IL - 1β诱导的细胞死亡过程中 ,凋亡占主导地位 ,并呈现剂量和时间依赖性。细胞经过 10 -11mol/LIL - 1β处理 72h后 ,出现凋亡典型的DNA梯状条带 ,与上述结果一致。 结论 :IL -1β能够诱导人黑色素瘤A375 -S2细胞凋亡 。