紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响

目的探讨紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响。方法建立A375细胞与HaCaT细胞的共培养细胞体系,实验分为对照组(等体积培养液),紫铆花素低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组,0.5,1.0,5.0μg/L)。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测细胞的周期分布和线粒体膜电位;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测干细胞因子(SCF)和其受体c-Kit,以及小眼畸形相关转录因子(MITF)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞酪氨酸酶相关蛋白1,2(TRP-1,TRP-2)及SCF,c-Kit,MITF的蛋白表达水平。结果与对照组比较,中、高剂量组细胞的增殖率均显著升高(P<0.01);与对照组比较,各剂量组G0/G1期细胞比例均显著降低,S期和G_(2)/M期细胞比例均显著升高(P<0.01),高线粒体膜电位细胞比例均显著升高(P<0.05或P<0.01),SCF,c-Kit,MITF的mRNA表达水平及SCF,c-Kit,MITF,TRP-1,TRP-2的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论紫铆花素可能通过调节SCF,cKit,MITF的表达而影响A375细胞与HaCaT细胞共培养细胞的增殖、细胞周期和线粒体膜电位等细胞生物学活性。

紫菜多酚对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和诱导凋亡的影响及机制探讨

以紫菜为原料,通过乙醇溶剂提取、硅胶柱层析、高效液相制备色谱等步骤,得到紫菜多酚组分C1、C2、D1、D2四个组分.通过MTT法测定组分C1、C2对人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖抑制作用,结果表明:组分C1、C2作用于A375细胞48 h的IC50分别为1.10、1.58 mg·m L-1.采用Annexin V/PI双染测定细胞凋亡情况发现,A375细胞经紫菜多酚组分C1处理后凋亡的细胞比例增加.经组分C1作用的A375细胞中黑色素含量和相对酪氨酸酶活力均得到提高,且与药物浓度呈正相关关系;透射电镜检测A375细胞超微结构的变化发现紫菜多酚组分C1可诱导A375细胞趋向正常分化.

红景天苷对人皮肤黑色素瘤细胞A375侵袭的影响

目的探讨红景天苷对人皮肤黑色素瘤细胞A375侵袭的影响。方法采用细胞培养技术培养的人皮肤黑色素瘤细胞A375,经不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00μg/mL)红景天苷处理后,应用结晶紫染色法,检测人皮肤黑色素瘤细胞A375对基膜黏附的影响;应用tran-swell小室模型,观察人皮肤黑色素瘤细胞A375在药物影响下侵袭、迁移能力的改变;采用细胞黏附实验、重组基底膜侵袭实验、趋化性运动能力实验以及小鼠黑色素瘤自发性转移模型,观察红景天苷对B16-BL6细胞生长、黏附、侵袭、运动及转移能力的影响。结果与对照组比较,红景天苷各浓度组能显著抑制黑色素瘤细胞与基膜的黏附,抑制其迁移和侵袭,差异显著,有统计学意义(P<0.05),并且药物组之间随药物浓度的增高其抑制作用增强,组间差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论红景天苷对人皮肤黑色素瘤细胞A375具有抑制侵袭的功效。

全反式维A酸、阿维A和他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及意义

目的探讨全反式维A酸(ATRA)、阿维A及他扎罗汀对人黑色素瘤细胞A375凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表达的影响及其意义。方法采用体外培养和流式细胞仪检测细胞凋亡(AnnexinV-PI法),SABC免疫细胞化学方法检测细胞Bax/Bcl-2蛋白表达情况。结果浓度均为10-5mol/L的ATRA、阿维A及他扎罗汀能不同程度地诱导了人黑色素瘤细胞A375凋亡,其中阿维A作用最为显著,凋亡率13.42%,明显高于对照组、ATRA及他扎罗汀组(均P<0.05);其次为ATRA(5.03%,明显高于对照组及他扎罗汀组,P<0.05)和他扎罗汀组(凋亡率2.88%)。3种维A酸亦使A375细胞Bax蛋白阳性表达增强而Bcl-2蛋白阳性表达减弱(P<0.05),其中阿维A作用最强,其次为ATRA和他扎罗汀。结论维A酸促进A375细胞凋亡可能部分通过以线粒体为核心的凋亡途径。阿维A可能是防治黑色素瘤的有效药物。

家蝇胚胎细胞抗菌肽对黑色素瘤细胞A375抑制作用的实验研究

目的 研究家蝇胚胎细胞MDEC-07114抗菌肽对黑色素瘤细胞A375的抑制作用.方法 利用脂多糖诱导家蝇胚胎细胞MDEC-07114提取抗菌肽.将家蝇胚胎细胞抗菌肽分为40,80,160,320和640 μg/ml五个实验组,同时以PBS和培养基作为正常对照组.采用MTT比色法测定不同浓度抗菌肽作用下细胞生长曲线,流式细胞术观察抗菌肽对黑色素瘤细胞A375周期及凋亡的影响.结果 ①在不同浓度家蝇胚胎细胞抗菌肽作用下,黑色素瘤细胞A375的生长受到明显的抑制,药物浓度越高、作用时间越长,对细胞的抑制作用越强.②各浓度组抗菌肽引起A375细胞的G2/M期升高,高浓度组（＞160 μg/ml）可引起G0/G1期降低,PI明显升高,与正常对照组相比差异具有统计学显著性意义（F=214.89,P＜0.05）.与正常对照组相比,各实验组引起的A375细胞凋亡率差异无统计学显著性意义（F=14.17,P＞0.05）.结论 家蝇胚胎细胞抗菌肽对肿瘤细胞的抑制作用随着药物剂量的增加和作用时间的延长而增强.家蝇胚胎细胞抗菌肽对A375细胞的抑制机理可能主要是阻滞细胞周期的正常发育.

毛蕊异黄酮对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移及侵袭的影响

目的：研究毛蕊异黄酮对人黑色素瘤细胞A375增殖、迁移及侵袭的影响.方法：以人黑色素瘤细胞A375为研究对象,MTT法检测不同浓度的毛蕊异黄酮对A375细胞活性的影响,划痕实验检测A375细胞的迁移,Transwell小室检测A375细胞的侵袭作用;qPCR检测A375细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）及基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达水平.结果：毛蕊异黄酮在6.25 ～ 100 μmol/L浓度内不能抑制A375细胞的增殖,划痕实验及Transwell检测结果显示毛蕊异黄酮可显著抑制A375细胞的迁移及侵袭（P＜0.01）,qPCR结果显示毛蕊异黄酮能抑制A375细胞MMP-2及MMP-9的表达.结论：毛蕊异黄酮在小于100 μmol/L浓度时抑制A375细胞的迁移及侵袭,其机制可能与抑制MMP-2及MMP-9表达有关.

慢病毒介导的CDK2-shRNA促进黑色素瘤细胞A375凋亡

目的探讨慢病毒介导的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2-shRNA对人黑色素瘤细胞A375凋亡的影响。方法依据CDK2基因序列,设计3条靶向干扰CDK2的序列,构建CDK2-shRNA慢病毒载体,质粒转染人胚肾细胞株(HEK293)细胞进行慢病毒包装,滴度测定包装的重组p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒,免疫印迹检测对CDK2的干扰效率及对细胞周期蛋白(cyclin)E、E2F1、RB蛋白表达的影响,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测A375凋亡的发生。结果成功获得包装的重组p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒,病毒滴度为5×108TU/ml。重组的p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒能有效下调CDK2、cyclin E、E2F1蛋白表达,抑制A375细胞增殖和触发凋亡。结论基于慢病毒介导的CDK2-shRNA能够促进黑色素瘤细胞A375凋亡发生,为黑色素瘤的基因治疗提供理论支撑。

IFN-β与恶性黑色素瘤细胞A375的关系

目的探讨恶性黑色素瘤细胞A375肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis induced ligand,TRAIL)诱导凋亡的敏感性。方法采用MTT法及流式细胞术分别检测不同浓度的可溶性TRAIL蛋白单独处理以及联合IFN-β处理后A375细胞的增殖率和凋亡率。采用western-blot、免疫组化方法检测TRAIL单独处理及联合IFN-β处理后A375细胞内TRAIL受体及凋亡相关蛋白的表达差异。结果 TRAIL蛋白联合IFN-β处理的恶性黑色素瘤细胞A375中TRAIL受体DcR1、DcR2、DR4、DR5表达增高,肿瘤细胞抑制率,凋亡率增加。与单独处理相比,联合处理后A375细胞内凋亡相关蛋白caspase8、caspase9表达上调,NF-κB下调。结论 IFN-β能通过上调黑色素瘤A375细胞内凋亡相关蛋白增加TRAIL受体的表达从而增强A375细胞对TRAIL的敏感性。

干扰黑色素瘤细胞A375中miR-210的表达对细胞转移及金属基质蛋白酶相关分子的影响

目的探究黑色素瘤中微小RNA-210(miR-210)的表达情况及干扰人黑色素瘤细胞A375中miR-210的表达对细胞转移能力及金属基质蛋白酶(MMP)表达的影响。方法收集西安交通大学第一附属医院病理科2016年3月1日至2017年5月31日的37例皮肤恶性黑色素瘤组织,17例交界痣组织及30例正常皮肤组织,荧光定量链式聚合酶反应(qPCR)检测组织中miR-210的表达情况。体外培养A375细胞,慢病毒转染空白载体及小干扰RNA(si RNA)介导的干扰miR-210载体于A375细胞中,分别作为对照组及干扰组细胞,qPCR检测两组细胞miR-210、MMP-2及MMP-9 mRNA表达水平,Western blot实验检测两组细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达水平,Transwell侵袭实验检测两组细胞侵袭能力,Transwell迁移实验检测两组细胞迁移能力。结果与交界痣及正常皮肤组织相比,黑色素瘤组织miR-210表达显著增高[(0.165±0.060)vs(0.076±0.033)及(0.048±0.046)],差异均具有统计学意义(P<0.05);与对照组细胞相比,干扰组细胞miR-210[(0.153±0.037)vs(0.372±0.041)]、MMP-2 mRNA[(0.175±0.053)vs(0.424±0.038)]及MMP-9 mRNA[(0.323±0.068)vs(0.610±0.102)]表达水平显著下调,差异均具有统计学意义(P<0.05);与对照组细胞相比,干扰组细胞MMP-2[(0.114±0.016)vs(0.356±0.047)]及MMP-9[(0.263±0.030)vs(0.571±0.084)]蛋白表达水平显著下调,差异均具有统计学意义(P<0.05);与对照组细胞相比,干扰组细胞侵袭细胞数显著减少[(36.9±8.7)个vs(72.3±10.5)个],干扰组细胞迁移细胞数也显著减少[(45.3±9.4)个vs(78.3±12.6)个],差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论恶性黑色素瘤中miR-210存在高表达,体外干扰A375细胞miR-210的表达可介导MMP分子表达下调,进而抑制细胞转移能力,是潜在的分子靶向治疗位点。

白藜芦醇对缺氧诱导的皮肤黑色素瘤细胞A375侵袭及上皮细胞间质转化过程的影响

目的探讨白藜芦醇对缺氧诱导的人皮肤黑色素瘤细胞A375侵袭及上皮细胞间质转化(EMT)过程的影响及其机制。方法取对数生长期的A375细胞分为正常对照组、缺氧组和缺氧+白藜芦醇组,正常对照组A375细胞在常氧条件下培养,缺氧组A375细胞在缺氧条件下培养,缺氧+白藜芦醇组A375细胞在缺氧条件下培养,并给予50μmol·L-1白藜芦醇干预。培养48 h后,四甲基偶氮唑盐法检测A375细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞侵袭力,实时聚合酶链反应检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA的表达,Western blot检测HIF-1α蛋白、上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达。结果培养48 h时,缺氧组A375细胞增殖能力、侵袭能力明显高于正常对照组(P<0.05);缺氧+白藜芦醇组增殖能力、侵袭能力明显低于缺氧组(P<0.05)。培养48 h时,3组A375细胞中HIF-1αmRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);缺氧组A375细胞中HIF-1α、Vimentin蛋白表达显著高于正常对照组(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达显著低于正常对照组(P<0.05);缺氧+白藜芦醇组A375细胞中HIF-1α、Vimentin蛋白表达显著低于缺氧组(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达显著高于缺氧组(P<0.05)。结论白藜芦醇可抑制缺氧诱导的黑色素瘤细胞A375增殖和迁移能力,其机制可能与抑制缺氧诱导的HIF-1α蛋白上调和EMT有关。

白藜芦醇对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇对人黑色素瘤细胞A375体外增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法用不同浓度的白藜芦醇作用于人黑色素瘤细胞A375,通过MTT法和HE染色法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响;TUNEL末端标记法和Annexin V-FITC双标记流式法检测白藜芦醇对细胞凋亡的影响。结果不同浓度白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞均有抑制增殖和促进凋亡的作用,并存在剂量和时间依赖性。结论达到一定浓度的白藜芦醇对人黑色素瘤A375细胞有明显的抑制增殖作用,主要通过诱导A375细胞凋亡(主要是早期凋亡)抑制其增殖。

肿瘤特异性凋亡基因对人黑色素瘤细胞A375凋亡诱导作用

为观察肿瘤特异性凋亡基因(apoptingene)对人黑色素瘤细胞A375的凋亡诱导作用,用含有凋亡基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375,采用台盼蓝染色法、RT-PCR及DNA凝胶电泳等方法研究其在不同时间条件下对人黑色素瘤细胞A375诱导凋亡的作用。结果表明,凋亡基因瞬间转染的人黑色素瘤细胞A375可出现明显的细胞凋亡;而且凋亡细胞的数量与转染时间有关。结论:凋亡基因具有诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡的作用。

紫外线对黑色素瘤细胞A375自噬与凋亡诱导效应

目的:探究紫外线(UV)对黑色素瘤细胞A375自噬的诱导效应及自噬与凋亡之间的相互调控。方法:模拟日光UV(95%UVA,5%UVB)照射A375后,自噬慢病毒监测不同时间点细胞自噬的变化;流式细胞术分析30 m J/cm2混合照后6、9 h细胞凋亡的变化;蛋白质印迹法检测30 m J/cm2照并干扰自噬后对凋亡标志蛋白的影响。结果:(1)UV能诱导A375自噬,10、30 m J/cm2的UV照后6 h能监测到细胞形成自噬体、9 h达高峰,50 m J/cm2照射组在照后6 h达自噬高峰且持续到观察时间的结束;(2)单纯UVB对自噬的诱导能力明显高于单纯UVA,且二者表现为协同效应;(3)30 m J/cm2的UV照射,在照后9 h发现Caspase 3、9表达降低,抑制自噬后,6、9 h凋亡标志蛋白Caspase 3、9表达增高,两组细胞在6、9 h的早期凋亡百分率差异显著(P<0.01)。结论:UV能够诱导A375自噬,UVB的贡献高于UVA。UV诱导的自噬能够推迟凋亡发生,对细胞起保护作用。

人胎儿真皮间充质干细胞对人恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用观察

目的 观察人胎儿真皮间充质干细胞(FDMSCs)对人恶性黑色素瘤细胞(A375细胞)增殖、迁移、侵袭的抑制作用。方法 通过酶消化法从16~20孕周的人意外流产健康胎儿的背部皮肤中提取FDMSCs,并进行鉴定。选取A375细胞并分为3组,F-CM组加入FDMSCs条件培养基,A-CM组加入成人真皮成纤维细胞条件培养基,Control组加入DMEM低糖空白培养基,利用CCK-8细胞增殖实验、划痕细胞迁移实验、细胞侵袭实验测算各组细胞相对活力、细胞迁移率、侵袭细胞数。结果 FDMSCs可以从人胎儿皮肤中成功提取并体外培养,阳性表达间充质干细胞(MSCs)特异性标记CD44、CD90、CD105及胚胎组织特异性标记SSEA-4、OCT-4,且具备成脂、成骨、成软骨的多向分化能力。与Control组比较,F-CM组细胞相对活力下降,细胞迁移率低,侵袭细胞数少(P均<0.05)。结论 FDMSCs可抑制A375细胞的增殖、迁移和侵袭。

1例脑膜恶性黑色素瘤的脑脊液细胞学检查

脑膜恶性黑色素瘤是中枢神经系统较为少见的肿瘤,其恶性程度高、预后差[1-2]。脑脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)细胞学检查对于疾病的诊断具有重要的参考价值。宁夏医科大学总医院神经内科于2018年收治了1例脑膜恶性黑色素瘤患者,现报道该病例的CSF细胞学变化及黑色素瘤细胞的形态特征。

丝氨酸羟甲基转移酶2对人皮肤黑色素瘤细胞增殖的影响

目的研究丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)对人皮肤黑色素瘤细胞增殖的影响及作用机制。方法通过GEPIA在线数据库分析人皮肤黑色素瘤中SHMT2的表达情况及其与β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达的相关性。通过嘌呤霉素进行压力筛选获取稳定表达SHMT2的人皮肤黑色素瘤A-375-SHMT2细胞株,采用细胞计数、CCK-8法、流式细胞术分别检测SHMT2对细胞增殖和细胞周期的影响,Western blot检测β-catenin及其下游分子Cyclin D1和c-Myc蛋白的表达。萤火虫荧光素酶报告系统实验(TOP/FOP-Flash luciferase reporter assay)检测wnt/β-catenin信号通路的活性。在稳定表达SHMT2的A-375-SHMT2细胞中使用XAV-939抑制wnt/β-catenin信号通路活性后,观察细胞增殖的变化。结果GEPIA在线数据库分析的结果显示,SHMT2在人皮肤黑色素瘤患者肿瘤组织中高表达(P<0.05),SHMT2表达与β-catenin、c-Myc和Cyclin D1呈正相关(P<0.05)。成功筛选获得稳定表达SHMT2的A-375-SHMT2细胞系及对照细胞系A-375-GFP。与A-375-GFP组相比,A-375-SHMT2组细胞的增殖能力更强(P<0.05),处于细胞周期G0/G1期的细胞比例降低(P<0.05),S期和G2/M期的细胞比例增高(P<0.05)。Western blot和双荧光素酶TOP/FOP实验的结果显示SHMT2增强wnt/β-catenin信号通路活性(P<0.05),并上调β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的表达(P<0.05)。在A-375-SHMT2细胞中使用XAV-939抑制wnt信号通路后可以逆转SHMT2对细胞增殖的促进作用及对Cyclin D1和c-Myc的上调效应(P<0.05)。结论SHMT2通过激活wnt/β-catenin信号转导通路活性促进人皮肤黑色素瘤细胞的体外增殖。

误诊为毛母细胞瘤的结节型黑色素瘤一例

本文报道一例误诊为毛母细胞瘤的结节型黑色素瘤。患者,女,53岁。头皮孤立的半球形肤色质硬结节2年,临床诊断为毛母细胞瘤。经组织病理及免疫组化检查,最终诊断为结节型黑色素瘤。

串内频率对高频纳秒脉冲串诱导A375黑色素瘤细胞电穿孔的影响

高频纳秒脉冲串能有效杀伤肿瘤细胞,但是其杀伤机制,特别是串内频率对诱导电穿孔效应的影响机制仍不清楚。以A375黑色素瘤细胞为研究对象,开展了细胞活性检测、短时/长时荧光染料检测以及细胞微观形态学检测等离体细胞实验,研究高频纳秒脉冲串的串内频率对细胞膜电穿孔的影响机制。细胞活性实验结果表明,高频纳秒脉冲串能有效杀伤肿瘤细胞,串内频率存在使细胞活性显著降低的阈值100k Hz;荧光染料实验结果反映细胞活性降低是由不可逆电穿孔引起,并且存在串内频率对电穿孔的累积效应;扫描电镜实验结果直接验证了高频纳秒脉冲串诱导肿瘤细胞发生了不可逆电穿孔。该实验结果为高频纳秒脉冲串杀伤肿瘤细胞的机制提供了实验依据。

原发灶不明的淋巴结转移性浆细胞样黑色素瘤1例并文献复习

黑色素瘤是一种起源于黑素细胞谱系的侵袭性皮肤恶性肿瘤。它表现为侵袭性生长模式,容易扩散,特别是发生淋巴结转移。黑色素瘤的病理形态学表现多样,当其转移到淋巴结时,淋巴结内转移瘤的细胞形态也各不相同。免疫组织化学染色的运用对于黑色素瘤的诊断与鉴别诊断具有重要的意义。然而,并非所有的黑色素瘤细胞均表达黑色素细胞标记,有的只是部分表达甚至表达缺失。

CDC25C表达下调的黑色素瘤细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡情况观察

目的探讨细胞分裂周期蛋白25C(CDC25C)对黑色素瘤B16细胞线粒体应激反应和线粒体途径凋亡的影响。方法取黑色素瘤B16细胞进行培养,将细胞随机分为转染组、转染对照组、空白对照组。转染组转染CDC25C低表达慢病毒质粒,转染对照组转染慢病毒空质粒,空白对照组正常培养。利用Rhod-2/AM与MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内Ca^(2+)浓度及线粒体活性氧(ROS),RT-qPCR法和Western blotting法分别检测细胞线粒体应激反应相关分子ClpP、LONP1及线粒体途径凋亡相关分子Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达。结果与转染对照组和空白对照组相比,转染组细胞线粒体Ca^(2+)及ROS含量增加,ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05或<0.01)。结论CDC25C表达下调激活黑色素瘤B16细胞发生线粒体应激反应,并诱导线粒体途径的细胞凋亡。