响应面法优化黑苹果发酵工艺及其抗氧化活性评价

该研究以苹果为原料,采用发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)混合发酵制备黑苹果,通过单因素试验和响应面试验优化黑苹果最佳发酵工艺,系统探究了接种量、混菌比例、发酵温度和相对湿度对黑苹果的颜色参数、褐变程度(A420 nm值)、类黑精含量、总酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)的影响。结果表明,黑苹果最佳发酵工艺为发酵粘液乳杆菌与嗜热链球菌比例1.5∶1.0,混菌接种量7.5%,相对湿度54%,发酵温度56℃。在此优化条件下,黑苹果的类黑精含量为189.64 g/kg,DPPH自由基清除能力34.24μmol Trolox/g,FRAP值为31.09μmol Trolox/g,分别比未发酵的新鲜苹果提高了8.87倍、4.15倍和6.41倍。综上,黑苹果的类黑精含量及抗氧化活性显著增加。

基于黑苹果果皮花青素的虾鲜度指示膜的制备及应用

以壳聚糖(chitosan,CS)、海藻酸钠(sodium alginate,SA)为成膜基材,通过添加黑苹果果皮花青素(black apple peel anthocyanin,BAA)提取物制备智能指示膜(CS-SA-BAA薄膜),并将其应用于虾新鲜度监测。分析比较BAA提取物添加量对复合薄膜微观形貌、厚度、颜色、机械性能、水分质量分数、紫外线透过率等的影响;并进一步研究利用复合薄膜监测虾新鲜度的可行性。结果表明:添加BAA提取物到复合薄膜中使组分之间发生了相互作用,BAA提取物在复合薄膜中分散良好,且复合薄膜机械性能得到显著提升,水分质量分数和紫外线透过率下降。此外,BAA提取物在pH 1~14范围内颜色由红色变为黄色,对酸碱度有明显响应,含有15%BAA提取物的复合薄膜对pH值敏感,可将其应用于虾新鲜度指示。在4℃下贮藏的第5天,虾的总挥发性盐基氮含量和pH值超过了虾的腐败阈值,表明虾已经腐败,同时复合薄膜的颜色由最初的红色变为深灰色。因此,CS-SA复合膜可作为良好的载体固定BAA以制备智能指示膜,用于虾新鲜度监测。

Vm-milRN7调控苹果树腐烂病菌致病的功能及机理

【背景】microRNA-like RNA(milRNA)是真菌中普遍存在的一类与动植物microRNA具有相似生成和作用机制的调控因子,广泛参与其生长、发育,以及植物病原真菌的侵染致病等生命活动。苹果树腐烂病菌(苹果黑腐皮壳Valsamali)引起的腐烂病是影响苹果生产的最具毁灭性的病害。【目的】探究Vm-milRN7调控苹果树腐烂病菌致病的功能及机理,为苹果树腐烂病的靶向性抗病育种提供理论依据。【方法】以03-8菌株基因组DNA为模板扩增Vm-milRN7前体序列并构建Vm-milRN7前体过表达载体;扩增Vm-milRN7前体上下游序列并利用Double-joint PCR技术构建Vm-milRN7前体敲除盒。利用PEG介导的原生质体转化法构建Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体。通过培养皿内生长试验及离体枝条、叶片接种试验分析Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体对病菌营养生长及致病的功能。利用qRT-PCR以及烟草共转化试验验证Vm-milRN7对其靶标基因Vm-09496的调控作用;使用生物信息学软件对Vm-09496进行蛋白序列特征和系统发育分析。为解析其功能,创制Vm-09496的敲除突变体以及回补菌株,并鉴定其表型。【结果】利用PEG介导的遗传转化技术获得Vm-milRN7过表达转化株以及敲除突变体。营养生长观察发现,与野生型菌株相比,Vm-milRN7过表达转化株生长表型无明显差异,而敲除突变体营养生长速率显著降低;致病力检测发现,Vm-milRN7过表达转化株对苹果叶片的致病力显著增强,敲除突变体对苹果叶片和枝条的致病力均显著降低。qRT-PCR和烟草共转化试验分析发现,Vm-milRN7能够抑制其候选靶标基因Vm-09496的表达。生物信息学分析发现该基因编码一个假想蛋白,且与梨黑腐皮壳(V.pyri)中的VP1G_09956进化关系最近。创制Vm-09496的敲除突变体和回补菌株,发现与野生型菌株相比,敲除突变体对枝条和叶片的致病力均显著提高,而回补菌株营养生长速率及致病力恢复至野生型水平。【结论】Vm-milRN7通过调控靶标基因Vm-09496的降解参与苹果树腐烂病菌致病过程。靶标基因Vm-09496是影响腐烂病菌侵染的重要内源基因,在苹果树腐烂病菌内负向调控致病力。

林芝“黑钻”苹果的贮藏特性分析

以林芝“黑钻”苹果为研究对象,测定其在高原常温贮藏条件下矿物质元素、VC和可溶性固形物含量及糖酸比,并考察其挥发性物质的变化。结果表明,随着贮藏时间的延长,苹果的可溶性固形物含量和糖酸比呈先上升后下降的趋势,VC含量持续下降,而矿物质元素含量保持较稳定;贮藏期间,苹果的挥发性香味物质主要为氮氧类化合物、无机硫类化合物及有机硫类化合物。该研究结果可为评价高原环境下苹果的贮藏品质提供理论依据。

增施硫酸镁钾肥对黑卡苹果果实品质的影响

以昭阳地区4年生黑卡苹果树为试材,采用穴施方法,施用0kg/株、10g/株、50g/株、100g/株红牛硫酸镁钾肥,探究其对黑卡苹果果实品质的影响。结果表明,增施红牛硫酸镁钾肥能不同程度地改善黑卡苹果的果实品质。其中,施入量10g/株时黑卡苹果的抗坏血酸和可溶性糖含量显著高于其他处理,果实硬度、含水量、可溶性糖含量、有机酸含量均比对照分别高6.99%、0.58%、12.5%、31.35%,但可溶性固形物含量最低。从4个处理的果实品质综合评价得分来看,施肥量从优到劣为:10g/株>100g/株>50g/株>0g/株。说明红牛硫酸镁钾肥对提高苹果果实品质具有增效作用,其中以施入10g/株为最佳的施肥量。

辽西地区苹果黑点病发生调查

2011年对辽西地区苹果黑点病的发生情况进行了调查,结果显示,辽西地区苹果黑点病总体发病较重,品种间发病存在差异,珊夏、富士、金冠品种发病重;药剂的选择和果袋质量是苹果黑点病发生的关键。田间病果分离结果表明,辽西地区苹果黑点病主要是由粉红聚端孢霉引起的真菌病害,6月连阴雨的气象因素是造成该病流行发生的主要因素。根据调查结果和影响病害发生的各种因素,我们提出套袋前将治疗性和保护性杀菌剂混用来控制苹果黑点病发生的防治措施。

苹果黑点病症状及病原菌鉴定

近年在甘肃省天水、陇南苹果产区发现苹果果实黑点病 ,经对其病原菌形态、培养性状和致病性等方面的测定表明 ,其主要致病菌为苹果柱盘孢霉 (Cylindrosporium pomiBrooks) ,其次为苹果茎点菌 (PhomapomiPass)。该病在苹果不同品种果实上造成的症状不同 ,将其归纳为 5种症状类型。

不同月份降雨量对套袋苹果黑点病的影响

为明确不同月份降雨量对套袋苹果黑点病的影响,以‘红富士’苹果树为试材,于2011、2012和2013年调查山东烟台、陕西白水、河南三门峡套袋苹果黑点病发病率,记录不同月份降雨量,通过统计分析不同月份降雨量对套袋苹果黑点病发病率的影响。结果表明:不同年份苹果黑点病发病率不同,2011年>2012年>2013年。3个地区苹果黑点病的平均发病率由东向西依次降低,具体表现为山东烟台>河南三门峡>陕西白水。1、4、5、7月的降雨量与苹果黑点病发病率成负相关,但是相关性均不显著(P>0.05);而其他月份降雨量与苹果黑点病发病率成正相关,其中9月降雨量极显著地影响了苹果黑点病的发生,Pearson相关系数达0.861(P<0.01)。8月和9月平均降雨量与苹果黑点病发病率的Pearson相关系数达0.862(P<0.01)。1、7、10月降雨强度与苹果黑点病发病率成负相关,但是相关性均为不显著(P>0.05);而其他月份的降雨强度均与苹果黑点病发病率成正相关,特别是6、8、9月这3个月降雨强度与苹果黑点病发病率的Pearson相关性均为显著(P<0.01)。其中8、9月平均降雨强度对苹果黑点病发病率的Pearson相关系数达0.907(P<0.01)。以上结果表明,8、9月降雨量和降雨强度与苹果黑点病发病率密切正相关,由此推断8、9月是防治苹果黑点病的关键时期。

甘肃天水套袋苹果黑点病的发生与综合防治

2006—2009年连续4年对甘肃省天水市套袋苹果黑点病的发生情况做了系统调查研究。初步掌握了天水地区套袋苹果黑点病的发病原因及与之有关的影响因素;提出了农业防治与化学防治相结合的综合防治方法;并筛选出了80%大生M-45可湿性粉剂800倍液等高效、低毒、环保、安全的药剂。

套袋苹果黑点病致病因素的研究进展

针对我国套袋苹果黑点病发生越来越严重的问题,各地陆续进行了相关研究。普遍的研究认为套袋苹果黑点病的主要致病因素有不良的气候条件和果园环境、纸袋质量差及套袋技术不规范、农药使用不当、害虫危害、营养亏缺与失调等,这为其防治提供了理论依据。

套袋苹果黑点病药剂防治试验

田间防治试验结果表明,于套袋苹果黑点病侵染期、发病初期、发病盛期各喷1次3%克菌康(中生菌素)可湿性粉剂600倍液进行防治,防效达92.04%,与3%多抗霉素可湿性粉剂400倍液的防效无显著性差异,与化学杀菌剂90%三乙膦酸铝可溶性粉剂600倍液+50%多菌灵可湿性粉剂800倍液的防效差异极显著。同时发现3%克菌康可湿性粉剂在防治套袋苹果黑点病的同时,也可起到防治苹果斑点落叶病的作用。

苹果黑腐皮壳菌侵染苹果枝干过程的转录组分析

苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali var.mali)引起的苹果树腐烂病是我国苹果产区发生严重的病害之一,了解病原菌侵染寄主不同时期的基因表达有助于揭示病菌的致病机制和苹果抗病机制。本实验应用Illumina平台对苹果黑腐皮壳菌侵染不同时期的寄主枝干发病过程进行转录组测序,同时通过与未侵染的病原菌和寄主组织进行比较。在病原菌侵染过程中,病原菌中发现4092个差异表达基因,寄主中发现16966个差异基因,通过对三个时期的上调差异表达基因进行GO和KEGG分析,结果表明病原菌侵染导致了寄主细胞壁降解、毒素物质合成、寄主抗毒物质分解和自身营养调节等过程;寄主主要通过膜脂过氧化作用、活性氧清除酶和防御酶抵抗病原菌的入侵。上述研究明确了苹果黑腐皮壳菌与寄主互作的生物学过程,为探讨病菌与寄主的分子互作机制奠定基础。

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

【目的】CAP(Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1)超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素(G418)抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素(HPH)抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区:N端信号肽、N端延伸区(NTE)、CAP保守功能域和C端延伸区(CTE)。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉(Neurospora crassa)CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属(Fusarium spp.)CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期(6 h和12 h)均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体(ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40);营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株(VmPR1a/C和VmPR1c/C)致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因(VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c),其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。

套袋苹果黑点病的发生及防治技术

通过几年来对套袋苹果黑点病的调查观察,了解了黑点病的发生规律、影响因子,分析了发病原因,提出了黑点病的防治技术。

管理及环境因素对套袋红富士苹果黑点病发生的影响

2019-2021年研究不同管理措施及环境因素对套袋红富士苹果黑点病发生的影响,研究结果表明:乔化果园、矮密果园8月发病率分别为25%和18%,矮密果园比乔化果园发病率低7%。乔化果园、矮密果园套优质果袋黑点病发病率分别为13.5%和6.9%,与套普通果袋相比乔化果园发病率下降12.1%,矮密果园发病率下降11.0%。乔化果园经过树形改良后发病率是6%,与改形前的果园发病率相比降低7.5%。同是未改形的乔化果园,谢花70%后喷1~2次杀虫、杀菌剂套袋,与间隔7~10d、连喷3~4次杀虫、杀菌剂后套袋,乔化果园和矮化果园黑点病发病率分别降低46%和47%。选用矮化密植栽培模式、对乔化果树进行高光效树形修剪、选择优质果袋且套袋前科学喷药能有效降低苹果黑点病发生程度。

甘肃天水套袋苹果黑点病的发生与防治

天水市武山县位于甘肃省东南部,境内光照充足,气候温和,雨量适中,昼夜温差大,优越的自然条件使其成为我国苹果的主要产地之一,打造出了驰名中外的'花牛苹果'品牌。近年来,随着环境、气候条件和生产管理方式的转变,导致部分区域套袋苹果黑点病发生严重,制约了当地苹果产业的健康发展。笔者根据多年的生产管理实践经验,对甘肃省天水市套袋苹果黑点病的发生情况进行了调查,并提出了相应的防治对策,仅供参考。

不同苹果园果实摘袋前的管理技术要点

本文所说的摘袋前是指苹果谢花后至解袋前的4月下旬至9月底,这期间是整个苹果园管理的重要环节,关系到苹果红点病、苹果黑点病及苹果苦痘病的多少以及果实的大小、表光的好坏、花芽的形成、叶部病害的轻重、树体结构的形成等,不同树龄的苹果园管理不同。

中国苹果树腐烂病发生和防治情况调查

2008年4～5月，通过国家苹果产业技术体系网络系统，对我国10个苹果主产省市的147个果园进行了苹果树腐烂病发生和防治情况调查。结果显示，在所调查苹果树中，总体发病率达52．7％。随着树龄的增大，腐烂病发病株率提高，4～10年生果树株发病率为26．8％，11～17年树龄的果树株发病率为54．0％，18~24年树龄的树株发病率为59．3％。不同省份之间以及不同品种之间，腐烂病在发生程度上存在一些差异，但不很明显。在腐烂病的化学防治中，石硫合剂是使用最多的药剂。在刮治病斑中，使用最多的是福美胂，其他还包括松焦油、腐殖酸、腐殖酸铜、过氧乙酸等。调查中发现防治腐烂病的用药比较混乱，由于福美胂毒性高，在无公害果园生产中已被禁用，因此研究替代福美胂的药剂成为当务之急。

2011年烟台苹果产区腐烂病发病情况调查与原因分析

为了解2011年烟台苹果产区腐烂病的发生情况,2011年5月,在腐烂病发病较重的栖霞、海阳等地选择21个农户的果园,对腐烂病的发生情况进行了调查。结果表明,21个果园中具有新病疤的病株率为68.20%,死株率为2.76%,平均受害枝量为23.98%,死枝量10.74%,病株率超过50%的果园占25%～30%,总体发病情况比一般年份严重。调查共发现967块新病疤,平均每株2.32块,其中源自剪锯口的病疤占80.04%,从旧病疤复发的病疤占60.29%。2010年秋季的连续阴雨、冬季低温和2011年春季干旱可能是导致烟台苹果产区2011年春季腐烂病大发生的主要原因。剪锯口是腐烂病菌侵染的主要途径,旧病疤复发是春季腐烂病发病的主体。

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hph)进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm·d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm·d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。