黑鲷×真鲷杂交子代与真鲷的Calmodulin基因克隆与表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得的黑鲷(Acanthopagrus schlegelii,♂)×真鲷(Pagrus major,♀)的杂交子代F_1(AP)与真鲷(Pm)的两组Calmodulin(CaM)基因序列。通过生物软件分析了两者的差异及所表达的蛋白质特性;同时,应用实时荧光定量PCR技术检测了APCaM与PmCaM在仔鱼及2龄鱼的6种不同组织中的表达特征。结果表明:1)克隆得到APCaM与PmCaM的cDNA全长分别为1 230 bp、1 210bp,两基因序列均具有一个450 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码了一个由149个氨基酸组成的多肽,该多肽包含有高度保守的4个EF-hand功能结构域。杂交F_1与真鲷的CaM基因非翻译区差异位点主要在3'端,ORF区域有5个氨基酸差异。2)两基因与其它鱼类的核苷酸序列相似性最高为95%,与氨基酸序列相似性最高为100%;从基因序列结构及蛋白质属性表明APCaM与PmCaM属保守的CaM基因家族。3)定量分析表明CaM在检测组织中均有表达,其中APCaM在脑中表达量最高,PmCaM在性腺中表达最高;APCaM与PmCaM在脑、肌肉、性腺及鳃中的表达存在显著差异(P<0.01),在肝、肾组织及仔鱼中的表达无显著差异(P>0.05);结合杂交F_1与双亲本在生长及性腺发育上的性状,推测CaM可能与生长及性腺发育调控有关。这些结果为探讨CaM基因在杂交F_1及真鲷亲本中的作用及鲷科育种研究提供基础资料。

黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子二代仔鱼早期发育及饥饿不可逆点

以黑鲷(Acanthopagrus schlegelii♀)×真鲷(Pagrus major♂)杂交子一代为亲鱼,于2017年4月在水温(21.8±0.4)℃条件下,对自然受精、人工孵化获得的杂交子二代(F_2)早期仔鱼进行发育观察,并就饥饿对仔鱼早期生长与存活的影响及不可逆点(point of no return,PNR)进行研究。结果表明,杂交F_2初孵仔鱼全长(2.40±0.15)mm,仔鱼3日龄开口摄食,混合营养期4~5 d,7日龄全长增长到(3.95±0.04)mm,生长态势正常;杂交F_2仔鱼开始摄食的初次摄食率及最高摄食率分别为45.8%及77.21%,6日龄时初次摄食率下降为29.83%,抵达PNR时间;饥饿仔鱼5日龄时负生长,全长与对照组有显著差异(P<0.05),6日龄时全长与对照组有极显著差异(P<0.01)。研究表明杂交F2早期仔鱼具有较好的生长态势;其开始投饵的最适时机应于仔鱼开口后的3 d内。

黑鲷 ×真鲷杂交子代回交繁育及子代早期发育观察

为筛选获得类型丰富、具杂交优势的海水养殖新品种,在黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子代养殖成功的基础上,于2016年4—5月,挑选经强化培育的杂交子代(♂)及黑鲷(♀)为亲鱼(雌雄配比1∶1),养于室内同一水泥池,水温16~20℃,盐度23~25,收集同步发育的自然受精卵进行孵化,采用显微摄像观察,记录回交子代胚胎和早期仔鱼的发育时序与形态特征。试验结果显示,回交子代的受精卵孵化、胚胎及仔鱼发育正常;在水温18~20.2℃、盐度25、微充气的条件下,受精卵历时42.5h完成胚胎发育,仔鱼孵化出膜;初孵仔鱼全长为2.08~2.45mm;在水温18~21.8℃、盐度23~25的条件下,经过约4d时间,仔鱼卵黄囊消失,完成早期仔鱼发育阶段。试验表明,黑鲷(♀)×真鲷(♂)杂交子代的可育性,也为进一步的鲷科优良品种选育提供更多基础资料。

黑鲷♀×真鲷♂反交子代与黑鲷的CaM基因克隆与mRNA表达分析

为分析黑鲷♀×真鲷♂(Acanthopagrus schlegelii♀×Pagrosomus major♂)反交子代在生长、发育等经济性状优于黑鲷亲本(A.schlegelii)的分子遗传差异,本研究克隆了反交子代(PA)与黑鲷(As)的Ca M基因,运用生物信息学方法对基因PACa M与As Ca M的序列进行了详细分析;同时通过荧光定量分析了PACa M与As Ca M在仔鱼及2龄成鱼不同组织的表达特征。研究结果表明,PACa M基因c DNA全长1180 bp,As Ca M基因c DNA全长1241 bp,均具有一个450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,分子量约16.84 k D,等电点为4.09;序列比对、结构比较等分析表明,PACa M和As Ca M属Ca M基因家族,具有4个EF-hand钙结合功能域。定量分析表明Ca M在两种鱼的仔鱼及成鱼的脑与性腺中有较高表达;PACa M和As Ca M在仔鱼及成鱼的鳃、肌肉及性腺中的表达存在显著差异(P<0.05),在脑、肝及肾中的表达没有明显差异(P>0.05);PACa M在仔鱼中表达量最高,As Ca M在成鱼性腺中表达最高,均显示了Ca M基因在生长与繁殖中的重要作用。研究结果为鲷科属间杂交获得的子代与亲本性状差异的功能基因表达提供一些基础资料。