东北大黑鳃金龟幼虫高毒力球孢白僵菌菌株的筛选及应用

为了筛选到针对靶标害虫东北大黑鳃金龟幼虫高毒力球孢白僵菌菌株,通过室内生物测定,明确球孢白僵菌Bb QCGZL-1对东北大黑鳃金龟幼虫的致病力,并与其他药剂进行防效对比;同时通过盆栽试验测定了球孢白僵菌BbQCGZL-1在不同农作物上对东北大黑鳃金龟幼虫的防治效果。球孢白僵菌BbQCGZL-1在施药14d时校正死亡率达到75%以上,高于其他供试菌株;施药7d时LC50为1.21×10^(7)cfu/mL,当菌悬液浓度为1.0×10^(8)cfu/mL时,LT_(50)为8.82 d;室内生测试验和室外盆栽试验结果表明,在东北地区利用球孢白僵菌防治东北大黑鳃金龟幼虫时,球孢白僵菌Bb QCGZL-1与商品化的微生物源药剂在防治效果上无显著差异。球孢白僵菌BbQCGZL-1可作为防治东北大黑鳃金龟幼虫的有效微生物源药剂。

辽宁地区东北大黑鳃金龟再度猖獗发生原因的分析

文中从生态环境变化、作物结构改变及防治方法等3个方面,详细论述了近几年以东北大黑鳃金龟为主的地下害虫再度猖獗发生的原因,提出了在地下害虫发生严重的地区积极有效的防控地下害虫的策略,强调不能仅仅依靠种衣剂包衣种子,来达到防治东北大黑鳃金龟等地下害虫的观点。

华北大黑鳃金龟生物钟基因HoPer的克隆和表达模式分析

为明确华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita周期蛋白基因(Period,Per)的表达模式,本研究采用RACE技术从2龄幼虫中克隆到生物钟基因HoPer,并进行生物信息学分析;再采用RT-qPCR技术检测HoPer在不同发育阶段、雌雄成虫不同组织以及不同光周期下的表达水平。结果表明:HoPer编码1 172个氨基酸,蛋白分子量129.67 kDa,等电点为5.62。HoPer推导出的氨基酸序列中具有2个PAS和1个Period C结构域,是昆虫PER蛋白的典型结构特征。表达模式分析得出:HoPer在各个发育阶段均有表达,但在卵中的表达量显著高于其他发育时期;HoPer在雌雄成虫的头和触角中表达水平最高,其次为翅和足,在胸和腹中表达水平最低;雌雄成虫中HoPer在试验设定的5个光周期中未发现明显的表达差异。本研究为进一步阐明华北大黑鳃金龟HoPer基因功能以及其在生物钟网络中的调控作用提供了一定的参考。

嗜菌异小杆线虫侵染后暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫脂肪体和中肠组织超微结构观察

【目的】探究昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系Heterorhabditis bacteriophora strain Cangzhou侵染对蛴螬脂肪体和中肠的影响,进一步明确其对蛴螬的致病机理。【方法】采用透射电镜技术,观察暗黑鳃金龟Hololtrichia oblita(Faldermann)和大黑鳃金龟H.parallela Motschulsky 2龄幼虫被嗜菌异小杆线虫沧州品系侵染后其脂肪体和中肠组织的病理变化。【结果】血腔注射感染期病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系悬浮液24和48 h后,观察发现暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟2龄幼虫脂肪体和中肠的组织结构均按时序逐渐发生变化,起初表现为脂肪球变形或变小,颜色变浅,脂肪体细胞和中肠细胞内质网、线粒体肿胀,中肠微绒毛变形脱落等现象,48 h后包裹脂肪球的膜结构破裂,脂肪体细胞和中肠细胞线粒体破裂,内质网数量减少,中肠微绒毛大量脱落,同时核内染色质大量解离,核膜破裂。【结论】经昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系处理后,暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟两种金龟甲2龄幼虫脂肪体和中肠细胞均出现明显的病理变化过程,这是嗜菌异小杆线虫高效致死蛴螬的原因之一。本研究可为昆虫病原线虫作为一种生物防治手段在蛴螬的综合防治中更好地发挥作用提供理论依据。

东北大黑鳃金龟嗅感器超微结构

利用扫描电镜和透射电镜对东北大黑鳃金龟Holotrichia diomphalia成虫触角嗅感器进行超微结构研究。结果表明：其嗅感器集中于触角鳃片上,着生在表皮内陷形成的凹腔里。嗅感器包括锥形感器和板形感器两种,锥形感器根据锥体形状的差异可分为4种类型,板形感器根据盘体形状的不同可分为5种类型。嗅感器表皮为单壁,壁上具有微孔和孔道微管。嗅感器内神经元的数目并不一致,1 ~3个不等。雄性触角鳃片的长度长于雌性触角鳃片,并且雄性触角嗅感器的总数远远多于雌性,其中雄性板形感器的数目与雌性差异不大,但雄性锥形感器的数目却远远的多于雌性,几乎是雌性的9倍。由此推测锥形感器是感受性信息素的感器,而板形感器用于感受植物气味。

东北大黑鳃金龟对绿叶气味的触角电位及行为反应

利用触角电位(electroantennogram,简称EAG)技术和风洞试验,测试了东北大黑鳃金龟成虫对两种绿叶气味——反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇的电生理和行为反应:雌雄金龟子对两种气味都能产生EAG反应,其反应强度随着剂量的增加而增强,且对5-甲基-1-己醇的反应强度略高于对反-2-己烯醛的反应强度;雌虫对这些气味的EAG灵敏度高于雄虫。光周期不影响雌雄两性对这些绿叶气味的EAG反应。行为测试结果显示,反-2-己烯醛对成虫具有定向作用,5-甲基-1-己醇对成虫无显著的行为作用。

蓖麻叶对华北大黑鳃金龟引诱作用的研究

利用嗅觉仪、触角电位仪、田间笼罩试验等方法测定了蓖麻叶对华北大黑鳃金龟的引诱作用.结果表明,在嗅觉仪中,华北大黑鳃金龟对蓖麻叶粗提物的选择性显著大于其他11种供试寄主植物,在田间选择性试验中,华北大黑鳃金龟对蓖麻的选择性也显著大于其他供试植物,表明蓖麻叶片中存在具有诱虫活性的气味物质.研究还发现,蓖麻叶对大黑鳃金龟有麻痹作用,但无直接致死作用.

华北大黑鳃金龟对20种植物源挥发物的电生理和行为反应

[目的]发掘能影响华北大黑鳃金龟行为反应的植物挥发性物质,以利用化学生态学技术调控华北大黑鳃金龟的行为,达到绿色防控的目的。[方法]采用触角电位(EAG)及Y型嗅觉仪行为测定技术,对20种植物挥发物进行筛选。[结果]在10μg/μL浓度刺激下,顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、乙酸顺-3-己烯酯、辛醛和苯乙醇能引起华北大黑鳃金龟触角较强的电位反应,总体趋势雌虫反应大于雄虫。行为测试中,反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸顺-3-己烯酯、1-己醇、邻氨基苯甲酸甲酯吸引能力都显著高于对照正己烷,但辛醛和苯乙醇对华北大黑鳃金龟的吸引作用低于对照正己烷,并呈极显著差异(p<0.01)。[结论]华北大黑鳃金龟对本文所选的部分植物源挥发物对有显著的电生理和行为反应,该结果可为开发对其的田间引诱剂或驱避剂提供一定的理论依据。

营养和湿度对华北大黑鳃金龟生长发育和生殖的影响

以华北大黑鳃金龟为对象,研究了营养和湿度对其发育和生殖的影响。在室内条件下,以不同饲料饲养成虫,取食榆树叶的华北大黑鳃金龟产卵量最高,为107.1粒/头,其次是毛白杨叶,而取食玉米叶和刺槐叶的产卵量最低。在马铃薯块、甘薯块和花生米三种饲料中幼虫最嗜取食马铃薯块,且存活率最高,幼虫重量显著高于取食甘薯块和花生米的幼虫重量。土壤湿度对卵发育影响较大,土壤湿度为18%时,卵的孵化率最高为75.6%,过干过湿都不利于卵的孵化。以含有15.7 mg/cm^2水的滤纸在暗处培育卵,孵化率可达77.7%,这种卵的孵育方法操作简便,减少了土壤中病原微生物和土壤颗粒对卵的侵染及损伤。土壤湿度为15%-18%时最有利于幼虫的生长发育,高于或低于这一湿度,幼虫的死亡率均增加。饲养中发现,幼虫在低龄阶段死亡率最高,尤其在初孵幼虫生长发育的前30 d内,这可能与低龄幼虫体壁较薄,抵抗过干过湿以及物理损伤的能力较差有关。

昆虫病原线虫对大豆地下害虫东北大黑鳃金龟幼虫的致病力研究

蛴螬是一种对大豆为害严重的地下害虫。本试验应用昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematode,EPN)斯氏线虫Steinernema carpocapsae的4个品系和异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora的3个品系,分别以滤纸和沙子为介质对东北大黑鳃金龟幼虫进行致病力测定,筛选出异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora-1品系为防治东北大黑鳃金龟幼虫的较理想线虫品系,以沙子为介质时,校正寄生死亡率达95.83%。

鞘翅目害虫-华北大黑鳃金龟围食膜结构的初步研究

应用光学显微镜和生化技术，研究了华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）围食膜的基本结构和表面形态，初步分析了围食膜蛋白质的种类，蛋白质和糖的含量，测定了棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白对围食膜结构的影响。结果表明，华北大黑鳃金龟围食膜表面平滑致密，富有弹性，但与多数昆虫围食膜相比韧性较差，主要由蛋白质、糖和几丁质组成，其中蛋白质的含量约为36．25％，糖的含量约为8．91％，其他为几丁质等；经SDS—PAGE测定，围食膜的蛋白质种类较多，有28条多肽比较清晰，分子量多在17．6—320．3kDa。棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白不能降解华北大黑鳃金龟围食膜中的蛋白质。

18种杀虫剂对华北大黑鳃金龟和铜绿丽金龟的毒力比较

采用浸渍法,测定了18种杀虫剂对华北大黑鳃金龟和铜绿丽金龟2龄幼虫的室内毒力,并比较了供试杀虫剂对两种试虫的毒力差异。结果表明,氨基甲酸酯类杀虫剂和大多数有机磷杀虫剂对两种金龟子幼虫的毒力差异较小,其它各类杀虫剂对铜绿丽金龟的毒力显著高于对华北大黑鳃金龟的毒力。其中新烟碱类药剂对两种试虫毒力差异最大,如啶虫脒对铜绿丽金龟的毒力高于华北大黑鳃金龟159.61倍,另外,苯基吡唑类杀虫剂氟虫腈对两种试虫毒力也相差了85.73倍。

东北与华北大黑鳃金龟分类地位的研究(鞘翅目 :鳃角金龟科 )

采用 RAPD技术和杂交方法对东北大黑鳃金龟 ( H olotrichia diomphalia Bates1 888)和华北大黑鳃金龟 ( H.oblita( Faldermann1 935 ) )的分类地位进行了研究。作者应用 40条引物 ,采用 UPDGA法对华北大黑的南京和文登种群、东北大黑的沈阳种群 ,以及其外群矮臀鳃金龟 ( H .ernesti Reitter)进行了 RAPD分析。所建立的系统发育树显示 ,东北大黑具有与华北大黑两个地理种群相同的分类地位。同时 ,作者对两种金龟甲进行了正反交的杂交试验。试验共得到 2 1头正交 F1代成虫 ,3头反交 F1代成虫 ,F1代生活正常。采用东北大黑与 F1代回交的方法研究 F1代的可育性。 2 0 0 1年 6月 1 0日的检查结果显示 ,四个处理均得到大量回交杂种一龄幼虫和少量二龄幼虫 ,F1代的雌雄虫均具有正常的生殖力。以上结果表明 :两种金龟是同一物种的不同地理种群 ,按照动物命名法规 ,东北大黑鳃金龟是华北大黑鳃金龟的次异名 。

金龟子绿僵菌和球孢白僵菌对大黑鳃金龟二龄幼虫的致病力

为了筛选生物防治大黑鳃金龟(Holotrichia diomphalia Batesa)的高毒力生防虫生真菌,室内生物测定和比较了金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae Metschnikoff(Sorokin)]KMa0107菌株、球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin]菌株Bb070610和Bb070917对大黑鳃金龟2龄幼虫的致病力。结果表明:接种后5~12 d,KMa0107,Bb070610和Bb070917菌株对大黑鳃金龟2龄幼虫的致死剂量对数值间差异显著(F=19.45,P<0.01),分别为(9.45±1.71)^(4.73±0.37)、(9.76±1.87)^(5.20±0.79)、(10.48±1.24)^(5.99±0.43)。用密度为1.15×108~1.15×105个/m L的孢子悬浮液接种后,对大黑鳃金龟2龄幼虫侵染致病的LT50估计值范围为5.7~8.7 d,6.4~9.2 d,6.3~8.6 d。接种孢子悬浮液后,随着病原菌的侵染及其在虫体内的繁殖,大黑鳃金龟2龄幼虫血淋巴中蛋白质质量浓度逐渐减少。接种后第4天,幼虫血淋巴中蛋白质质量浓度均明显下降,接种KMa0107及Bb070610的大黑鳃金龟2龄幼虫血淋巴蛋白质质量浓度下降速度显著大于Bb070917菌株处理。接种后第10天,菌株KMa0107及Bb070610处理的大黑鳃金龟2龄幼虫血淋巴蛋白质质量浓度显著低于对照及Bb070917菌株处理(F=17.36,P<0.01)。综合以上结果,金龟子绿僵菌KMa0107及球孢白僵菌Bb070610菌株对大黑鳃金龟2龄幼虫具有较强的致病力,具有良好的生防制剂开发潜力。

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶,为了了解该类酶的分子特性及功能,本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库,首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列,命名为HoSP1(GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明,该基因长902bp,开放阅读框(ORF)长783bp,编码260个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.7kDa和4.19,不含有N-糖基化位点,但在Thr157处有一个O-糖基化位点,含有6个保守的半胱氨酸残基,组成3对二硫键,对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现,该酶具有组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)催化中心,与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性,其中与CzSP3的序列一致性最高,为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后,进行体外表达,以BTEE为底物,测得该酶的活力为0.0378μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。

华北大黑鳃金龟性信息素组分的分离与鉴定

对华北大黑鳃金龟性信息素活性腺体和非活性腺体的甲醇提取液分别进行了 GC分析 ,筛选出与活性有关的组分 A。经 GC- MS分析数据库检索鉴定 A为 1个环状二肽。人工合成这种环状二肽及与其有关的甘氨酸甲酯等 4种氨基酸酯 ,作为华北大黑鳃金龟性信息素的候选化合物。将候选化合物纯化后进行室内活性测定 ,结果表明 ,甘氨酸甲酯可激活华北大黑鳃金龟雄虫的性行为 。

重要地下害虫东北大黑鳃金龟研究进展

东北大黑鳃金龟 Holotrichia diomphalia 是我国东北地区重要的蛴螬类地下害虫,主要危害麦类、玉米、豆类等大田作物,以及薯类、花生等经济作物。华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita 和江南大黑鳃金龟 Holotrichia gebleri 是华北及江南地区的主要蛴螬类害虫。近年来,传统分类学、杂交实验以及分子生物学的研究都证明, 3种鳃金龟是同一个物种的不同地理种群,这些研究成果使东北大黑鳃金龟从一个区域性害虫转变成为分布范围从东北到长江流域的广布害虫。本文综合介绍了东北大黑鳃金龟(包括华北大黑鳃金龟、江南大黑鳃金龟)近二十年来的研究成果,包括分类学、发生规律、防治措施,以及生理生化及分子生物学等,并对东北大黑鳃金龟的综合治理研究进行了展望。

土壤含水量对华北大黑鳃金龟生长发育的影响

室内试验研究土壤含水量对华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann生长发育的影响。结果表明,土壤含水量对华北大黑鳃金龟的影响因其发育阶段的不同而异。卵期适宜土壤含水量为10%～20%,幼虫期、蛹期适宜土壤含水量分别为10%～15%和15%～20%。土壤含水量为10%～15%时,成虫性比接近1∶1。土壤含水量为15%时,世代存活率最高。

两种线虫对东北大黑鳃金龟（Coleoptera：melolonthidae）的侵染效果

室内试验表明，昆虫病原线虫Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ种的Ａ２４品系和Ｈｅｔｅｒｏｒｈｏｂｄｉｔｉｄｂａｃｔｅｒｉｏｐｈｏｒａ种的Ｈ０６品系对东北大黑鳃金龟ＨｏｌｏｔｒｉｃｈｉａｄｉｏｍｐｈａｌｉａＢａｔｅｓ的幼虫均有一定的侵染力．剂量为５８０条／ｃｍ２Ａ２４品系进行土壤表面喷洒时．蛴螬的校正死亡率为７６．１８％；而剂量仅为１２０条／ｃｍ２的Ｈ０６品系，蛴螬的校正死亡率为１００％，且后者侵染速度明显快于前者．

球孢白僵菌对东北大黑鳃金龟(Coleoptera: Melolonthidae)的侵染效果

从东北大黑鳃金龟（ＨｏｌｏｔｒｉｃｈｉａｄｉｏｍｐｈａｌｉａＢａｔｅｓ）成虫体中分离出一株球孢白僵菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｉａｎａ（Ｂａｌｓａｍｏ．）Ｖｕｉｌ．。室内试验表明，它对金龟子的感病率为６１．３％，２龄蛴螬的最高死亡率为５３．３％。该株球孢白僵菌对东北大黑鳃金龟２龄幼虫的毒力略大于绿僵菌Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ（Ｍｅｔｃｈ．）Ｓｏｒ．（４５．６％），明显大于卵孢白僵菌Ｂ．ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉ（Ｓａｃｃａｒｄｏ）Ｐｅｔｃｈ（２０％）