鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性

目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株sipB和crp基因缺失对其侵袭力影响的比较

目的:为探讨sip B和crp基因对侵袭能力的影响。方法:以鼠伤寒沙门菌SL1344株sip B和crp缺失株为研究对象,进行生物学特性以及体内外侵袭力的研究。结果:生物学特性结果表明,sip B缺失株生化特性和亲本菌株相比没有发生明显的变化,而crp缺失株失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,并且生长速度较亲本菌株相比发生了显著的降低。体内侵袭力结果表明两个实验组小鼠肝脏和脾脏分离到的细菌数目均低于对照组,体外感染He La细胞结果显示sip B缺失菌株组的黏附率和侵入率较crp组和对照组均发生了显著的降低。结论:以上结果表明sip B基因在细菌侵染机体过程中扮演着重要的角色。

鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344ΔcyaΔasd)。将含asd基因且无抗性的p YA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌rpoN基因缺失株构建及生物学特性研究

为了探索σ因子RpoN在鼠伤寒沙门菌生物被膜形成过程中的作用,对两株生物被膜形成能力较强的鼠伤寒沙门菌利用Red同源重组系统构建rpoN基因缺失株,利用原核表达载体构建回复株;比较野生株、缺失株和回复株的生物被膜形成能力和对环境应激抵抗力的差异,并通过建立的csgA和bcsA基因实时定量PCR方法检测编码生物被膜成分基因的表达差异。结果显示,与野生株相比,△rpoN缺失株生物被膜形成能力增强,主要由卷曲菌毛表达量显著增加引起。回复株生物被膜形成能力与野生株相似。△rpoN缺失株在酸性应激和碱性应激条件下对外界环境应激的抵抗力均显著增强。RpoN为鼠伤寒沙门菌中生物被膜形成相关σ因子之一,为进一步研究沙门菌生物被膜形成的调控机制提供理论基础。

上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的鉴定和耐药谱分析

目的了解2013—2015年上海市流行的鼠伤寒沙门菌单相变异株的基因型和耐药谱。方法对2013—2015年上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室保存的1 179株分离自腹泻患者的沙门菌进行血清分型复核,结合聚合酶链反应(PCR)筛选、鉴定鼠伤寒沙门菌单相变异株。采用PCR检测鼠伤寒沙门菌单相变异株基因型。采用改良纸片扩散法对鼠伤寒沙门菌双相株和单相株进行14种抗菌药物体外药物敏感性试验,参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判断结果。结果 1 179株沙门菌中共检出鼠伤寒沙门菌单相变异株52株,在沙门菌和鼠伤寒沙门菌中的阳性率分别为4.4%和23.3%,病例来源主要为上海郊区,且以青中年人群为主。在52株鼠伤寒沙门菌单相变异株中,有44株(84.6%)fljB基因缺失;在8株fljB基因未缺失株中,有2株(3.8%)基因型为fljB+fljA-hin-,6株(11.6%)为fljB+fljA+hin+。药物敏感性试验结果显示,耐3类以上抗菌药物的单相株有40株(76.9%),耐4类以上抗菌药物的单相株有36株(69.2%),并且鼠伤寒沙门菌单相株对氨苄西林-链霉素-磺胺类药-四环素(ASSu T)的耐药率(61.54%)和对氨苄西林-氯霉素-链霉素-磺胺类药-四环素(ACSSu T)的耐药率(19.23%)均远高于双相株(10.6%)(P<0.05)。结论上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株检出率较高且人群分布不均,多重耐药性严重,在疾病防控中应注意合理布局资源和使用药物。

河南省人源产ESBLs鼠伤寒沙门菌单相变异株的分子特征研究

目的分析河南省腹泻病例粪便标本中产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的鼠伤寒沙门菌单相变异株耐药情况,并研究其分子学特征。方法对河南省腹泻粪便中分离的124株鼠伤寒沙门菌单相变异株沙门菌,通过肉汤稀释法进行抗生素敏感性试验并筛选产ESBLs菌株;PCR方法检测β-内酰胺酶编码基因携带情况,采用质粒接合试验分析耐药基因的水平转移情况,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行亲缘关系分析。结果124株鼠伤寒沙门菌单相变异株沙门菌耐药严重,其中有16株为产ESBLs菌株。16株产ESBLs菌株均携带CTX-M型耐药基因,并检测出OXA型和TEM型耐药基因;其中9株菌可将CTX-M基因通过质粒转移到大肠埃希菌J53,药敏分析发现其他抗生素的耐药性可以发生共转移。16株产ESBLs鼠伤寒沙门菌单相变异株沙门菌经XbaⅠ酶切后共分为14种带型,无明显的优势带型。结论检出产ESBLs的鼠伤寒沙门菌单相变异株沙门菌基因型具有多样性,耐药基因可通过接合性质粒在不同菌属间播散。

鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测

作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素 (stn)基因插入失活型与缺失型突变的重组自杀载体质粒 ,通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株 2 0 0 0染色体上野生型stn基因发生同源交换 ,筛选获得stn基因突变的同源突变菌株。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明 ,突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱 ,而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高 ,提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。

携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白活减毒鼠伤寒沙门菌口服重组DNA疫苗株的构建

目的:构建携带人幽门螺杆菌(H pylori)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)基因(napA)的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA 疫苗. 方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌. 结果:重组质粒经PCR及双酶切,证实成功构建了携带HP-NAP基因的重组真核表达质粒pIRES-napA,后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207.所克隆435bp napA与GenBank中SS1-napA核苷酸和蛋白质的同源性均为98%. 结论:成功构建并鉴定了携带HP-NA2P基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌口服DNA疫苗,为多价抗H pylori口服DNA疫苗的研制奠定了基础.

PhoQ基因重组鼠伤寒沙门氏菌株的构建及毒力研究

应用PCR技术从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA中克隆phoQ基因片段,构建原核表达pUC18重组质粒,测定序列(GenBank登录号为DQ787014),并转入鼠伤寒沙门氏菌,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,进行高效表达。对重组菌株、野生菌株进行毒力检测对比实验,通过口腔注入45日龄健康无菌KM小鼠,测定其半数致死量(LD50)。结果发现:重组菌株与野生菌株的毒力存在显著差异,其半致死量分别为3.981×107cfu/mland5.012×102cfu/ml,PhoQ基因重组菌株的毒力远远低于非重组菌株。说明phoQ基因是调节鼠伤寒沙门氏菌致病机制中一个重要的调节因子。

选择压法分离鼠伤寒沙门氏菌抗萘啶酮酸突变株（NaA－R）

本实验采用选择压法以不同水平（１０－１２０μｇ／ｍｌ）的萘啶酮酸液体和固体培养基从鼠伤寒沙门氏菌野株中选择出一株抗萘啶酮酸的抗药菌株，并对其应用作了初步尝试。

贵州省鼠伤寒沙门菌单相变异株的CRISPR基因型和遗传多样性研究

目的了解贵州省鼠伤寒沙门菌单相变异株规律的成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的基因型及遗传多样性,为贵州省沙门菌病的预防控制提供依据。方法对分离自2013—2018年贵州省7个市(州)的71株疑似鼠伤寒沙门菌单相变异株进行系统生化鉴定及血清分型,结合双重PCR法确定疑似菌株为鼠伤寒沙门菌单相变异株。提取鼠伤寒沙门菌单相变异株的DNA作为模板,进行CRISPR1和CRISPR2的PCR扩增,将阳性扩增产物进一步测序,获得菌株的CRISPR1和CRISPR2间隔序列,根据间隔序列的组成,确定CRISPR基因型,并使用Bionumerics软件对菌株进行遗传多样性分析。结果71株疑似鼠伤寒沙门菌单相变异菌株经系统生化鉴定、血清分型及双重PCR法鉴定为鼠伤寒沙门菌单相变异株,经CRISPR1和CRISPR2两个位点的PCR扩增和产物测序,71株菌共检测到163个间隔序列,其中CRISPR1有102个,CRISPR2有61个。联合CRISPR1和CRISPR2两个位点的间隔序列进行分析,发现71株菌被分为33个CRISPR基因型(TSTs),其中TST11和TST1为贵州省的优势基因型,分别占总菌株数的25.35%和12.68%。71株菌经Bionumerics软件聚类分析后被分为A、B、C、D 4个簇,A簇包含的菌株最多,B簇包含的基因型最多,不同来源的3株参考株独立成簇,D簇包含7个TSTs基因型。结论贵州省鼠伤寒沙门菌单相变异株具有优势的CRISPR基因型和遗传多样性的特点,可能有其他的感染来源。

鼠伤寒沙门菌sseK3基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的:检测sseK3基因的缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,为探究该基因的功能及开发安全有效的鼠伤寒沙门菌活疫苗提供了新思路。方法:通过重组自杀性质粒介导,两步筛选法敲除sseK 3基因并成功构建缺失菌株的回复菌株,进而检测其生物学和免疫学特性。结果:PCR、双酶切及测序结果证实成功构建了sseK3缺失株及其回复菌株。生物学特性研究表明,sseK3缺失菌株和亲本株SL1344血清型均为1,4,5,12:i:1,2,生化特性和生长速度无明显差异,且sseK3缺失株能够稳定遗传;sseK3缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD 50为2.96×10^8 CFU,与亲本菌株SL1344相比,sseK3缺失株的LD 50值升高约1 035倍,毒力显著下降;免疫保护效力实验显示:sseK3缺失株免疫后第17天保护率为66.7%;在免疫小鼠后的第14天血清IgG达到最高水平;回复菌株与亲本亲株生物学特性无显著性差异,基本回复到野生型水平。结论:成功构建了鼠伤寒沙门菌sseK3基因缺失株,可稳定遗传,毒力显著降低,具有良好的免疫原性,推测sseK3对鼠伤寒沙门菌的毒力具有重要的调节作用,为探究该基因的功能及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。

添加有机锌可减少蛋鸡饲料中鼠伤寒沙门菌株数量

锌是大量家禽饲料中需要补充的微量元素。美国研究者研究表明，加锌后，沙门菌放慢生长或停止生长。研究者将1％的醋酸锌或丙酸锌加入蛋鸡饲料中，对照试验组加丙酸钠和醋酸钠，在试验蛋鸡饲料中接种鼠伤寒沙门氏标准菌株，室温（20±1）℃状态保持9d，结果发现：在前4d，

添加有机锌可减少蛋鸡饲料中鼠伤寒沙门菌株数量

锌是大量家禽饲料中需要补充的微量元素。美国研究者研究表明。加锌后，沙门菌放慢生长或停止生长。研究者将1％的醋酸锌或丙酸锌加入蛋鸡饲料中．对照试验组加丙酸钠和醋酸钠，在试验蛋鸡饲料中接种鼠伤寒沙门氏标准菌株，室温（20±1）℃状态保持9d，

一起鼠伤寒沙门菌单相变异株引起的食源性疾病事件病原学分析

目的:对一起食源性疾病事件进行溯源调查和病原学分析。方法:结合流行病学调查结果共采集24份可疑食品及器具涂抹样本和17份患者粪便样本。对粪便样本采用Realtime PCR方法筛查病原,并开展流调样本的分离培养。对分离株进行血清学鉴定、PFGE分子分型、药敏试验和全基因组测序,根据全基因组测序数据预测分离株血清型、ST型别、耐药基因及毒力基因携带情况。结果:Realtime PCR结果提示粪便样本沙门菌基因检测阳性,流调样本分离培养得到7株沙门菌,均来源于患者粪便,经多种血清分型试验证实为鼠伤寒沙门菌单相变异株I4,[5],12:i:-。PFGE分子分型试验显示7株沙门菌带型完全一致。基于WGS测序数据预测引起该事件的致病菌为ST34型鼠伤寒沙门菌单相变异株;该分离株对氨苄西林、四环素、链霉素、多西环素及米诺环素耐药,携带aac(6’)-Iaa、aph(6)-Id、aph(3’’)-Ib、blaTEM-1B、sul2及tet(B)6个耐药基因;共注释110个毒力基因,其中101个毒力基因与沙门菌属致病阶段中的附着、侵袭和巨噬细胞内存活相关,未比对出与系统传播有关毒力基因。结论:本次食源性疾病事件是由鼠伤寒沙门菌单相变异株I4,[5],12:i:-感染引起,全基因组测序技术为食源性疾病事件的处理提供了更多的病原学信息。

屎肠球菌菌株NCIMB 10415显示对感染鼠伤寒沙门氏菌的断奶仔猪无益处

在欧洲鼠伤寒沙门氏菌是爆发沙门氏菌病的主要致病菌。该研究拟研究益生菌屎肠球菌NCIMB 10415能否预防或缓解沙门氏菌病。32头仔猪断奶后10天用鼠伤寒沙门氏菌进行攻毒试验．