一株鼠冠状病毒的全基因组序列特征分析

目的确定一株新型鼠冠状病毒全基因组序列特征及系统进化特征。方法采用高通量测序在内蒙地区采集的鼠肠道组织发现与已知冠状病毒差异较大的冠状病毒,拼接获得部分基因组序列,采用PCR验证扩增病毒基因组并采用RACE方法扩增基因组末端序列。采用MEGA软件进行多序列比对并构建系统发育树。结果本研究中发现的鼠冠状病毒经扩增获得其全基因组长度为27674 bp,命名为NMR-13,包括两端非编码区和8个开放阅读框,依次为5′UTR-ORF1ab-S-ORF3-E-M-ORF6-N-ORF8-3′UTR,其中ORF8仅在部分鼠类Alpha冠状病毒存在,功能尚不清楚,并且缺乏许多鼠类Alpha冠状病毒存在的NS2基因。同源性分析结果显示该病毒株属于Alpha冠状病毒属成员,与美国发现的FiCoV/UMN2020病毒株具有最高同源性,核苷酸同源性为91.3%,其次与我国浙江省发现的Lucheng/Lijiang-170,Lucheng/Ruian-83和Lucheng/Lijiang-71病毒株核苷酸同源性较高,分别为79.5%,80.6%和81.0%。系统发育分析也显示NMR-13与FiCoV/UMN2020具有最近的亲缘关系。重组分析未发现重组现象。结论本研究发现了一株鼠冠状病毒,丰富了鼠类中Alpha冠状病毒的多样性,为了解国内鼠冠状病毒的分子遗传特征及分子进化提供了参考依据。

螺内酯与氯沙坦对大鼠冠脉微栓塞后心室重构及心室功能的影响

目的在大鼠冠脉微栓塞(CME)模型上,观察CME后心室重塑及其机制,比较螺内酯联合氯沙坦和单用氯沙坦对CME后心室重塑及心功能的影响。方法自清洁级SD大鼠心尖部注入自体血栓微粒造成心肌内微小血管栓塞,建立CME模型。60只大鼠随机分成对照组(CL组)、假手术组(SO组)、冠脉微栓塞组(ME组)、螺内酯干预组(SP组)、氯沙坦干预组(LO组)、螺内酯联合氯沙坦组(SL组),每组10只。术后28 d取血浆及心脏标本。HE染色观察心肌内微小梗死灶数量(Nmmi),放射免疫检测血浆血管紧张素II (AngII)、血浆及心肌醛固酮(ALD)水平,Marsson染色检测心肌细胞间质胶原容积率(CVF),免疫组化法检测心肌组织TNF-α、IL-1β、活化NF-κB水平,硝酸还原比色法测定心肌组织中NO含量。超声心动图观察左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD),左室短轴缩短率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)。生理记录仪记录左心室舒张末期压(LVEDP),左心室收缩压(LVSP)和左心室腔内压力变化率最大值(±LVdp／dtmax)。结果ME组与SO组比较,Nmmi显著增加:CVF明显增加。ME组与SO组比较,LVEDD和LNESD明显增大,LVFS和LVEF明显降低;LVEDP明显增加,LVSP及±LVdp／dtmax明显下降。ME组与SO组比较,心肌TNF-α、IL-1增加,活化NF-κB水平升高,心肌组织内NO浓度升高。ME组与SO比较,AngII、ALD水平均明显升高。与ME组相比,SP组均能明显减少心肌各种细胞因子表达,升高组织内NO浓度;LVEDD、LNESD明显减小,LVFS明显上升,LVEF明显改善;LVEDP明显下降,±LVdp／dtmax显著上升。与LO组相比,SL组均能进一步明显减少心肌各种细胞因子表达,增加组织间NO浓度;LVEDD、LVESD明显减小,LVFS明显上升,LNEF明显改善; LVEDP明显下降,±LVdp／dtmax显著上升。结论大鼠CME后神经内分泌-细胞因子激活,心肌间质胶原纤维增生,心室重构及心功能受损。螺内酯联合氯沙坦较单用氯沙坦能进一步减少神经内分泌-细胞因子激活及心室重构。

鼠冠状病毒核衣壳蛋白的抗体制备与抗原决定簇分析

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白有稳定病毒基因组、调控病毒复制及细胞状态的特殊作用。鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus,MHV)为乙型冠状病毒属的原型病毒,是研究冠状病毒N蛋白功能的经典模型。本研究用去污剂处理鼠冠状病毒粒子暴露N蛋白,另用原核表达纯化的重组N蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆及单克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹分析结果显示两类抗体均具有高灵敏度和特异度,与甲型冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的N蛋白无交叉反应。原核表达缺失突变的N蛋白分析结果显示,多克隆抗体与单克隆抗体2E6识别的鼠冠状病毒N蛋白抗原决定簇完全一致,位于N端结构域(N-terminal domain,NTD)C端与SR之间的58个氨基酸残基内。此外,基于单克隆抗体2E6的ELISA及免疫荧光法能检测到感染细胞中和培养上清液中的N蛋白组分,且其含量与病毒复制的滴度一致。这些结果表明,鼠冠状病毒复制过程中粒子与细胞中的N蛋白可能维持相似的结构,使NTD与SR之间的部分氨基酸残基一直暴露在表面,从而形成了优势抗原决定簇。

大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR检测方法的建立与应用

目的建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法。方法根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对。结果双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%。仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×10~2 copies/μL。特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物。应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性。结论建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测。

DC-SIGN与mCEACAM1a分子相互作用调控鼠冠状病毒复制

树突细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素分子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)和肝/淋巴结特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素分子(liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecules-3-grabbing non-integrin,L-SIGN)是钙离子依赖的C型凝集素受体,通过识别病毒粒子表面含甘露聚糖或果糖寡聚糖的分子介导病毒进入细胞,但其在调节病毒复制中的作用较少被关注。本研究通过建立稳定表达DC-SIGN和L-SIGN及其功能域嵌合体的细胞系,分析两者过表达对鼠冠状病毒复制的影响。结果显示,L-SIGN比DC-SIGN更能显著抑制病毒复制,这种差异与两者胞内区序列和基序组成不同有关;鼠冠状病毒感染导致细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路分子磷酸化下调,过表达DC-SIGN和L-SIGN可抑制这种下调趋势。在没有鼠癌胚抗原相关细胞黏附分子1(mouse carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1,mCEACAM1)存在时,DC-SIGN不能介导病毒感染。这些结果提示,DC-SIGN通过与mCEACAM1a分子相互作用和调节细胞信号通路分子功能以调控鼠冠状病毒复制。

鼠冠状病毒核衣壳蛋白电荷非均一性与其磷酸化的相关性

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白是病毒必不可少的结构蛋白,具有保护病毒基因组和调控病毒复制进程的重要作用。作为冠状病毒的经典模型,鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)N蛋白的磷酸化调控病毒RNA复制转录和装配已有报道。本研究发现MHV-A59感染鼠neuro-2a细胞后期表达的N蛋白呈现明显的电荷不均一性,其中只有小部分发生磷酸化并被装配至病毒颗粒中;等电聚焦电泳显示N蛋白的电荷呈连续分布。用蛋白脂酰化抑制剂2-溴棕榈酸(2-BP)和蛋白酶体抑制剂MG-132处理后显示病毒复制水平不但与N蛋白电负性相关,而且与细胞的PKCαS657磷酸化和内质网蛋白水平相关。结果提示磷酸化修饰与鼠冠状病毒N蛋白电荷不均一性及稳定性密切相关。

结构域B在鼠冠状病毒S蛋白的抗原性及膜融合中的作用

棘突(spike,S)蛋白是冠状病毒表面必不可少的跨膜糖蛋白,在病毒进入宿主细胞时具有结合受体和诱导膜融合的双重作用。大部分冠状病毒S蛋白的受体结合域位于S1-CTD(即相对应的结构域B),而经典的乙型冠状病毒模型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)的受体mCEACAM1a与S1-NTD(即相对应的结构域A)结合,其结构域B的作用仍未完全清楚。本研究通过构建结构域B和S2膜融合元件的缺失突变体,并使其在鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a内成功表达,证实了结构域B对病毒S蛋白导致的细胞-细胞间膜融合是必需的。用不同方法处理的病毒颗粒作为抗原免疫小鼠,所获得的多克隆抗体进一步显示,结构域B不但是S蛋白的主要抗原决定簇,而且能诱导中和抗体明显抑制病毒感染和S蛋白介导的膜融合作用。此结果为阐述不同冠状病毒的致病性与感染性差异提供了新思路。

大蒜新素、双黄连对小鼠MHV-3性暴发型肝炎模型的作用

目的:探讨大蒜新素、双黄连在整体水平抗鼠肝炎病毒3型(MHV-3)感染效应.方法:将小鼠分为:大蒜新素、双黄连治疗组大蒜新素、双黄连预防组,大蒜新素、双黄连预防+治疗组,感染模型对照组,每组18只,及正常对照组,6只.建立MHV-3诱导的小鼠暴发型病毒性肝炎模型,通过观察模型小鼠存活时间、血浆ALT水平、肝脏病理改变和肝组织MHV-3病毒滴度变化,综合评估两种中药制剂的预防和治疗效应.结果:各组存活时间,血浆ALT水平、肝脏病理改变和肝组织MHV-3病毒滴度差异明显.大蒜新素预防组、双黄连预防组较模型组的病毒滴度(PFU/mg)明显减少(4.20±0.60,3.63±0.15vs6.07±0.25,均P<0.05);预防+治疗组较治疗组的病毒滴度(PFU/mg)也明显减少(3.70±0.44vs4.53±0.55,P<0.05);预防+治疗组较治疗组的病毒滴度(PFU/mg)明显减少(2.67±0.59vs3.77±0.31,P<0.05),预防组与预防+治疗组之间比较无明显差异.结论:大蒜新素、双黄连预防效应优于其治疗作用,可能作为冠状病毒流行期间人群预防的候选药物.

啮齿动物病毒和支原体感染的检测方法

前言对于生物学研究,啮齿动物的病毒和支原体污染,被广泛认为是棘手问题。动物一旦遭受感染,除了损害动物本身健康和生存外,还导致其它生物制品材料的污染以及改变动物生物学特征而使实验结果前功尽弃。因此,亟需建立一套有效的评价实验用动物的微生物状态的方法。能够精确知道动物是否已被病毒和支原体感染的有效途径,依赖于特异、敏感的监测方法。

云南白药外敷的新作用

本文仅对云南白药外敷的新作用简述如下。一、治疗肋软骨炎肋软骨炎又称泰齐氏病,为肋软骨非化脓性炎症,是一种多发病,主要症状为不明原因的胸壁肿胀疼痛,以2～4肋软骨多见,可单发,也可多发。