瘦素对体外大鼠成纤维细胞增殖与胶原合成的影响

目的 研究瘦素对体外培养大鼠成纤维细胞 (fibroblast,FB)增殖与胶原合成的影响 ,以阐明 FB介导瘦素在大鼠皮肤创伤愈合中的促进作用。 方法 体外培养乳鼠真皮 FB,通过 MTT比色分析法、3H-胸腺嘧啶核苷(3H- Td R)和 3H-脯氨酸 (3H- Pro)掺入法观察不同浓度的瘦素 ,分别为 0、10、5 0、10 0、2 0 0及 4 0 0 ng/ ml对其增殖和胶原合成的影响。 结果 瘦素剂量在 4 0 0 ng/ ml以下时 ,随瘦素剂量增加明显增加了体外培养大鼠 FB MTT的光密度值和 3H- Td R的掺入量。3H- Pro的掺入量随瘦素剂量增加基本呈增大趋势。 2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的3H- Td R掺入量 379±10 1cpm、32 6± 33cpm,与对照组 2 19± 5 6 cpm比较有统计学差异 (P<0 .0 5 ) ;且 2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的 MTT吸光度(A)值 0 .0 82± 0 .0 13、0 .0 91± 0 .0 18与对照组 0 .0 6 3± 0 .0 10比较有统计学差异 (P<0 .0 5 ) ;2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的 3H- Pro掺入量 911± 5 5 cpm、10 72± 2 5 9cpm,与对照组 6 79± 176 cpm比较有统计学差异 (P<0 .0 5 )。 结论 瘦素促进了 FB的增殖和胶原蛋白的合成 ,这可能是瘦素发挥促进大鼠皮肤愈合作用的途径之一。

胎鼠成纤维细胞组织块体外培养方法的改良

目的:建立改良的胎鼠成纤维细胞(MEF)体外培养的简单有效方法,为成功培养胚胎干细胞奠定基础。方法:分别应用传统的消化法和改良的组织块贴附培养法对MEF进行体外培养,倒置显微镜下观察2种培养方法培养的原代和传代培养的MEF的生长形态、结构及细胞数量的变化。结果与结论:改良组织块贴附培养法省去了消化离心过程,简单易行,培养的成纤维细胞具有良好的增殖能力,原代培养成纤维细胞增长快,细胞产出量高,明显优于消化法培养,是MEF体外培养的良好方法。

苯丙酸诺龙对大鼠成纤维细胞增殖作用的研究

目的 利用培养大鼠成纤维细胞 (fibroblast,FB) ,研究蛋白同化激素苯丙酸诺龙 (nandrolone phenyl-propionate,NP)对创伤后 FB的增殖作用。 方法 Wistar大鼠致伤后取材行 FB原代培养 ,实验组培养液按 NP用药剂量 0 .5～ 15 .0μg/ ml分为 NP1 ～ NP5共 5组 ,对照组为含 5 %胎牛血清的培养液 ,7d后 MTT法测定不同剂量 NP对FB存活力的影响 ,选作用最大的一组继续实验 ,流式细胞术测定 FB增殖指数。 结果 各 NP组 FB存活值均高于同时间点对照组 ,NP4 组第 1～ 7天差异均有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,NP5组从第 1～ 6天与对照组相比差异有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,而第 7天则无差异 ;流式细胞术检测 FB增殖指数显示 NP组均高于同期对照组 ,差异有统计学意义 (P<0 .0 1)。 结论 蛋白同化激素 NP能够促进 FB的复制增殖 ,且这种增殖作用有剂量依赖性。

pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响

【目的】研究Wilson病野生型基因ATP7BcDNA真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响。【方法】构建人Wilson病野生型基因ATP7BcDNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B。随机选取TX小鼠20只构建TX小鼠的成纤维细胞模型,平行分成3组,一组未加质粒,另两组分别加入等量pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B,观察对细胞模型铜代谢的影响。并进行免疫组化实验以观察表达是否增强。【结果】实验前未加质粒组,加入pcDNA3.1(+)组与加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组细胞内铜含量分别为(78±20),(77±17),(75±13)ng/mg;实验后分别为(76±20),(74±13),(40±10)ng/mg。与未加质粒组和加入pcDNA3.1(+)相比,加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组的细胞内铜含量显著下降(P皆<0.01),其细胞内ATP7B蛋白的表达明显增强。【结论】Wilson病真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B在TX小鼠成纤维细胞水平上确有排铜作用。

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .

EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究

本文应用 Western 印渍和原位免疫荧光定量技术,检测了两株经 EBV-DNABamHI-W(YH)片段转染后转化而建立的细胞株,CH-1和 CH-2所表达的 EBNA 亚型.结果发现,两株细胞均有一系列由27～38KD 小分子量的 EBNA5表达,同时可见 CH-1细胞有低水平的 EBNA2表达.对比起无 EBNA2表达的 CH-2细胞,CH-1细胞具有较低的接触抑制能力和附壁性,并且细胞蛋白质的代谢也有较明显的改变,提示 EBNA2和 EBNA5均与细胞转化有关。

小鼠成纤维细胞变身为多能干细胞

美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）干细胞生物学和医学研究所的研究人员最近获得一种新技术，能够将成纤维细胞再程序化为类似胚胎干细胞的多功能细胞。这一成果刊登于7月7日《Cell Stem Cell》杂志。

SMYD2特异性抑制剂对高糖环境下大鼠肾成纤维细胞活化的影响及其机制

目的:明确赖氨酸甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)特异性抑制剂对体外高糖(HG)环境下大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)活化的影响并探索其可能机制。方法:采用CCK-8法检测SMYD2特异性抑制剂LLY507对体外培养的NRK-49F细胞活力的影响。实验分组为正常糖(NG;含5.5 mmol/L葡萄糖)组、HG(含30 mmol/L葡萄糖)组、NG+LLY507(1.5μmol/L)组和HG+LLY507(1.5μmol/L)组,37℃培养48 h后收集各组细胞蛋白。采用Western blot实验检测SMYD2、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、纤维连接蛋白(fibronectin)、I型胶原蛋白(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、p-Smad3、Smad3、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)p65、NF-κB p-p65、白细胞介素6(IL-6)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)及p-STAT3蛋白水平。结果:LLY507浓度低于1.6μmol/L对NRK-49F细胞的活力无显著影响;与NG组相比,HG组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3,TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著升高(P<0.05);与HG组相比,HG+LLY507组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著降低(P<0.05)。结论:SMYD2特异性抑制剂LLY507可明显抑制HG诱导的NRK-49F细胞活化和细胞外基质分泌,其机制可能与阻断TGF-β1/Smad3、NF-κB和STAT3细胞信号通路激活相关。

罗格列酮对环孢素A所致大鼠成纤维细胞肾毒性的保护作用

目的观察免疫抑制剂环孢素A(CsA)对大鼠肾脏成纤维细胞(NRK)增生及细胞因子分泌的影响以及罗格列酮的干预作用,初步探讨罗格列酮对环孢素A肾毒性的保护作用。方法体外培养大鼠肾脏成纤维细胞。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定CsA及罗格列酮对细胞增生的影响。RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、TGF—β1mRNA水平。western印迹检测PPARγ、AT1受体、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)及FN蛋白表达。酶联免疫吸附(ELISA)测定细胞培养上清液中TGF-β1的分泌。结果CsA可明显抑制NRK细胞增生,且呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。罗格列酮与CsA合用后,对细胞增殖的抑制作用更明显(P<0.01)。CsA刺激NRK细胞PPARγ、TGF—β1、AT1受体及FN的产生(P<0.05),罗格列酮可下调这些改变(P<0.05)。结论罗格列酮可减轻CsA所致的NRK细胞毒性。

低氧微环境对胎鼠成纤维细胞HIF-1α和PTEN表达及细胞周期的影响

目的探讨低氧条件下HIF-1α和PTEN在胎鼠成纤维(MEFs)细胞增殖、分化中可能的调控作用,以及低氧对细胞周期的影响。方法低氧条件(5%O_295%N_2)下培养MEFs不同时间(0、2、4、6、8h)后,应用免疫细胞化学、RT-PCR检测方法,观察MEFs中HIF-1α和PTEN的表达并检测其细胞周期。结果免疫组化结果表明,HIF-1α及PTEN蛋白的表达均随低氧时间增长而逐渐增强。RT-PCR结果显示,HIF-1αmRNA吸光度值常氧组为(0.93±0.06),低氧2～4h组达高峰分别为(1.46±0.05)和(2.30±0.05),随后开始下降;PTENmRNA吸光度值常氧组为(0.78±0.08),低氧2～6h组逐渐达到高峰分别(1.10±0.11)和(1.61±0.23),8h开始呈现下降趋势(<0.05)。流式细胞仪分析显示,随着低氧时间延长,G0/G1期细胞从(86.72±0.41)%上升至(92.41±1.10)%,低氧使MEFs细胞周期阻滞于G1/G0期。结论低氧微环境阻滞MEFs细胞周期于G0/G1期可能与PTEN和HIF-1α过表达相关。

肝癌相关抗原HAb18G对小鼠成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶2、9的影响

HAb18G为高特异性地表达于肝癌细胞膜表面的一种膜抗原[1,2],本研究将HAb18G全长cDNA直接转染入小鼠成纤维细胞株NIH/3T3,建立高效表达HAb18G的小鼠成纤维细胞株,观察其对基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌所产生的影响,研究肝癌易于浸润转移的机制.

丝裂霉素C处理后鼠胚成纤维细胞活力分析

为了探讨丝裂酶素C处理后鼠胚成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）活力的变化规律，试验用10μg／mL丝裂酶素C处理MEF，研究丝裂酶素C处理时间及其处理后细胞接种量、血清浓度和细胞代次对MEF活力的影响。结果表明，用10μg／mL丝裂酶素C处理2和3h，MEF活力比处理4h的稳定，处理2h的MEF活力与处理3h的没有显著差异；用10μg／mL丝裂酶素C处理3h后，MEF以（0．8～1．6）×10^4／孔接种96孔板，其活力比2．0×10^4／孔和4．0×10^4／孔接种的稳定；用含体积分数10％犊牛血清培养液培养的MEF活力，比用含体积分数2％，5％，15％和20％犊牛血清培养液培养的稳定；第1，3代MEF活力比第5，7代的稳定。表明，用10μg／mL丝裂酶素C处理2～3h，第1，3代MEF以（0．8～1．6）×10^4／孔接种96孔板，用含体积分数10％犊牛血清培养液培养，是利用丝裂酶素C制备MEF饲养层的适宜条件。

EB病毒mir-BART-5促鼠成纤维细胞恶性表征机制研究

目的探讨EB病毒mir-BART5可促进鼠成纤维细胞恶性表征的作用机制。方法生物信息学分析显示miR-BART5与miR-18序列相近,miR-18的靶基因表达的结缔组织生长因子(CTGF)可促进细胞增殖。在鼠成纤维细胞NIH/3T3中瞬时转染mir-BART5-mimics使其表达上调,采用Western blot检测对照组与转染组细胞的CTGF表达,采用体外软琼脂集落生成试验观察两组细胞生长的恶性表征。结果转染组细胞在软琼脂上呈恶性表征。CTGF在转染组中表达上调(P<0.05),导致NIH/3T3细胞增殖能力增强。结论 EBV病毒miR-BART5通过调控miR-18途径上调CTGF的表达,从而促进细胞的恶性表征。

纳米TiO_2对鼠成纤维细胞Balb/c3T3遗传毒性的研究

目的探讨不同粒径、不同浓度的纳米TiO_2对鼠成纤维细胞的遗传毒性效应。方法分别用含有0μg/ml(对照组)、1μg/ml、10μg/m1、100μg/m1,浓度的30nm和50nm的Ti0_2的DMEM培养基培养鼠成纤维细胞Balb/c3T3,24h后,采用单细胞凝胶电泳实验方法检测DNA损伤,评价毒性效应。结果与对照组比较,30nm和50nm的Ti0_2颗粒当浓度大于1μg/ml时均可对细胞产生遗传毒性效应,差异显著(P<0.05),且随着浓度的增加毒性作用增强,当TiO_2浓度为1 00μg/ml时毒性作用最强。结论纳米二氧化钛对小鼠成纤维细胞具有遗传毒性作用,且遗传毒性与纳米TiO_2浓度呈剂量依赖效应。

再生丝素膜对鼠胚真皮层成纤维细胞遗传特性的影响

目的 :研究再生丝素膜 (WL组 ,HY组 ,SD组 )对大鼠鼠胚成纤维细胞的遗传物质的影响。方法 :采用浸提液法在体外培养鼠胚成纤维细胞 ,计算细胞的微核率 (MNF)和染色体畸变率 (CAF) ,用单细胞电泳法 (SCGEassay)检测基因组DNA的损伤程度。结果 :WL组、SD组再生丝素膜和空白对照组的细胞微核率 (MNF)和染色体畸变率(CAF)无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,无明显彗星现象 ;而HY组再生丝素膜与阴性对照比较有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :WL组和SD组再生丝素膜对种子细胞的遗传学特性无明显影响 ,优于HY组。

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的:探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法:取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论:两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。

鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长

目的:探讨以鼠胚成纤维细胞为饲养层分离、培养鸡胚胎生殖细胞的方法和条件。方法:分离、培养12.5～13.5d鼠胚成纤维细胞。分离孵化5.5d鸡胚原始生殖细胞,原代培养时不使用饲养层,与性腺基质细胞共培养;继代培养时将其置于鼠胚成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞。结果:鼠胚成纤维细胞可连续传代18代以上(4个月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的鸡胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过9代。集落未分化标志高碘酸希夫反应(PAS)呈强阳性,体外分化实验表明胚胎生殖细胞具有多能性。结论:用鼠胚成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。

羟丁基壳聚糖的制备及其与鼠胚胎成纤维细胞的生物相容性研究

目的制备温敏型壳聚糖衍生物羟丁基壳聚糖(Hydroxybutyl chitosan,HBC),研究鼠胚胎成纤维细胞(Mouseembryonic fibroblasts,MEF)与HBC的相容性,探讨羟丁基壳聚糖作为组织工程材料的可行性。方法对壳聚糖化学改性制备HBC,研究其最佳制备条件。使用不同溶剂对HBC进行溶解实验;利用红外光谱、扫描电镜对产物结构进行观察。从小鼠胚胎中分离培养MEF;MTT法测定HBC对MEF活性的影响。结果制备的4种HBC均能溶于水,55℃反应14 h的HBC 4水溶性较好。HBC溶液在37℃具有明显的溶胶-凝胶的转变,通过物理交联形成凝胶并可逆。不同反应条件下制得的4种HBC浸提液对MEF细胞的毒性均在0级或1级,表现出良好的生物相容性。结论成功制备羟HBC,HBC具有良好的温度敏感性及体温(37℃)下凝胶的特性,与MEF生物相容性良好,是一种具有应用前景的新型组织工程材料。

高密度脂蛋白介导大鼠皮肤成纤维细胞内胆固醇流出的机制

目的 研究高密度脂蛋白 3(HDL3 )介导大鼠皮肤成纤维细胞胆固醇 (ch)流出机制。方法 用N 乙酰咪唑修饰HDL ,阻断HDL与细胞受体相互作用 ,观察其对HDL3 介导细胞ch流出的影响。用FITC标记HDL示踪HDL3 在介导细胞ch流出中自身代谢过程。结果 牛血清白蛋白 (对照组 )介导 4.74%细胞ch流出 ,HDL3组和N 乙酰咪唑HDL组分别为 31 .85 %和 8.41 %。FITC HDL3 与细胞 37℃培养 3h后 ,细胞内吞荧光强度(FS)占细胞结合FS的 6 5 .78% ,其中 93.5 %FS存在于TCA可沉淀部分。细胞进一步 37℃培养 2h后 ,细胞释放FS占内吞Fs 80 .77% ,其中 92 .7%FS存在于TCA可沉淀部分。结论 HDL3 通过与细胞受体相互作用 ,介导细胞ch流出。其可能机制是HDL3 通过受体进入胞内 ,在胞内不经历溶酶体分解过程。它接受胞内ch后通过逆向胞饮形式流出胞外。

转化生长因子β1对大鼠肺成纤维细胞内皮素受体类型的影响

目的:探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠肺成纤维细胞内皮素受体(endothelin receptor,ETR)类型的影响。方法:体外培养大鼠肺成纤维细胞株,并随机分为TGF-β1干预组、对照组。TGF-β1干预组加入含TGF-β1(10 ng/mL)的FM培养基1 mL,对照组加入1 mL FM培养基。分别培养1 d、3 d、5 d,每组每时间点设3复孔。采用荧光定量PCR法观察各组各时间点ETRA、ETRB mRNA的表达水平。用Western blotting法观察各组各时间点ETRA、ETRB蛋白的表达水平。结果:TGF-β1干预组ETRA表达随着时间变化呈降低趋势,3 d、5 d时显著低于模型组(P<0.01);而ETRB表达随着时间变化呈升高趋势,3 d时高于模型组(P<0.05),5 d时显著高于模型组(P<0.01)。结论:TGF-β1刺激可诱导大鼠肺成纤维细胞ETR类型发生变化,ETRA表达减少,ETRB表达增加。