人抗小鼠抗体干扰化学发光法检测

目的探讨人抗小鼠抗体对化学发光法检测的干扰作用。方法用美国雅培、贝克曼、罗氏3个检测系统检测患者人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促甲状腺素(TSH)、CA125、HBs Ag、HIV-Ag/Ab及梅毒螺旋体抗体(TP-Ab),观察不同检测系统检测结果的差异;PCR法检测HBV DNA,免疫印迹法检测抗HIV抗体;将患者血清与异嗜性阻断剂1∶1混合后,在雅培检测系统上检测感染性标志物、心肌标志物、甲状腺功能相关指标、激素、肿瘤标志物等项目,观察人抗小鼠抗体对检测结果的影响。结果与贝克曼、罗氏检测系统相比,雅培检测系统上HCG、TSH、CA125、HBs Ag结果均增高,HIV-Ag/Ab出现阳性,TP-Ab无明显变化。HBV DNA拷贝数<1.0×10~2IU/mL,抗HIV抗体确证试验结果为抗HIV抗体阴性。患者血清中加入异嗜性阻断剂后,HBsAg、HBeAg、HIV-Ag/Ab、心肌标志物等基于双抗体夹心法检测的项目结果恢复正常,而间接法或竞争法检测的项目结果无明显变化。结论人抗小鼠抗体的存在对检验结果可能造成干扰,导致误诊或延误治疗。当出现与临床不符的可疑结果时,应及时与临床联系,寻找干扰原因,以保证检验结果的真实性与可靠性。

鼠抗CD4抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

为获得鼠抗人 T细胞分化抗原 4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用 RT- PCR技术 ,从 Wu T4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因 ,进行克隆并作核苷酸序列分析 ,发现 RT- PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为 4 0 0 bp左右 ,构建的 p MD18T- VL 和 p MD18T- VH 重组克隆载体 ,酶切与预期结果相符。测序得到它们的 DNA序列。结果表明 ,克隆的两条轻链可变区基因序列一致 ,长度均为 32 4 bp,属于鼠轻链 亚类。克隆的重链可变区基因长度为 375 bp,属于鼠重链 (C)亚类。

鼠抗人转铁蛋白抗体轻链与重链可变区基因库的制备

以纯化的人转铁蛋白免疫小鼠,测其血清效价,合乎要求后杀鼠取脾脏并以异硫氰酸胍和酚的混合溶液将其匀浆,再以氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤,所得总RNA以oligo(dT)纤维素离心柱分离纯化制备mRNA,使mRNA达到cDNA合成所需的浓度后,反转录制备出cDNA,在合成的cDNA中加入轻、重链引物,扩增制备出小鼠抗人转铁蛋白抗体的轻、重链可变区基因库。

抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的 :构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体 ,并实现其真核表达。方法 :从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因 ,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中 ,转染CHO细胞 ,实现其真核表达 ,并对抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定。结果 :成功构建抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体 ,并实现其真核表达。初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力。结论 :构建的抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想。

抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达

目的 :构建抗CD71人 鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体。方法 :将鼠源性抗CD71单抗 (75 79)重、轻链可变区基因 (VH 和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ Expr和pκ Expr中 ;将嵌合表达载体 (Chi75 79 pγ Expr和Chi75 79 pκ Expr)经电转染技术共转染至真核细胞 (SP2 0 )中。结果 :经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清 ,证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区 (Cγ)和轻链恒定区 (Cκ)蛋白 ;通过间接免疫荧光流式细胞术 (FCM)和间接免疫荧光显微技术 ,证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CD71分子。结论 :抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)在体外真核细胞表达成功。

抗人胃癌3H11人-鼠嵌合抗体的构建及表达

为了降低抗人胃癌鼠单抗3H11的免疫原性,以利于该单抗在临床中的应用。我们构建并表达了3H11的人-鼠嵌合抗体,将3H11的轻、重链可变区基因分别插入到含有人k链及IgGl重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,构建了3H11人-鼠嵌合抗体轻、重链表达载体。应用Lipofectin方法先将嵌合轻链表达载体转染到Sp2/0细胞中,经用含霉酚酸的选择培养基筛选及克隆化培养,获得稳定分泌3H11人-鼠嵌合轻链的转染细胞株。再将嵌合重链表达载体转染该细胞系,用含有组氨醇的选择培养基筛选,获得组氨醇抗性细胞株,经亚克隆后得到可稳定分泌人k链和人IgGl的转染细胞系,经ELISA检测该细胞系所分泌的上清含有可与人胃癌细胞系803结合的人IgG抗体活性,RT-PCR结果显示该细胞株有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录,证明已获得分泌3H11人-鼠嵌合抗体的细胞系。

抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达

目的 :构建和表达抗TNF α人 鼠嵌合抗体。方法 :将抗TNF α鼠单抗Z8的轻、重链可变区基因插入到含有人κ链和IgG1重链恒定区基因的真核细胞表达载体中 ,分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人 鼠嵌合抗体真核表达载体 ,转染真核细胞 ,通过ELISA、RT PCR、免疫印迹检测TNF α的活性。用L92 9细胞检测嵌合抗体体外中和TNF α的活性。结果 :ELISA鉴定结果表明该嵌合抗体与TNF α特异性结合 ;PT PCR结果显示转染后细胞系有人 鼠嵌合抗体mRNA的转录 ;免疫印迹结果证实有人IgG蛋白的表达 ;体外中和实验证明此嵌合抗体能中和TNF α对L92 9细胞的毒性。结论

组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-VL-VH,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb VL和VH的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-VL-VH,并进行酶切鉴定和测序。通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800μg/LG418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性。结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-VL-VH并在CHO细胞中表达。ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25mg/L。结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础。

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应

目的:在运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上,探讨B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/D28信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法:取6周龄雌性C57BL/6J小鼠,予一次性腹腔注射Pristane 0.5ml/只,每月定期检测小鼠的尿蛋白、ANA及肾脏病理学改变。取尿蛋白含量达到++,ANA荧光强度达到++的小鼠随机分为3组,每组5只。抗体干预组用B7-1人-鼠嵌合抗体经眼眶静脉序贯给药,阳性对照组注射免疫抑制剂CTX,阴性对照组注射人同型Ig G。每月定期检测尿蛋白及ANA,干预至3个月时,处死小鼠,取肾脏进行H&E染色分析,免疫复合物(IC)检测及透射电镜观察。结果:Pristane诱导至4个月时,80%的小鼠尿蛋白含量达到+^+++,血清ANA荧光强度为++^+++,出现尿蛋白及ANA的小鼠,其肾小球炎性细胞侵润,肾小管上皮样细胞可见水肿样变性、血管充血明显,纤维组织增生。抗体干预后,尿蛋白逐渐由++^+++降为±^++,ANA由++^+++降为+^++。与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.01)。肾脏HE染色分析的结果显示,抗体干预组肾小球炎性细胞侵润及肾小管充血等表现均得到明显改善。免疫荧光染色可见抗体干预组抗原抗体复合物(IC)的荧光强度明显减弱。经透射电镜观察,抗体干预组与阴性对照组相比,肾小球的电子致密物沉积减少,基底膜厚度趋于均匀。结论:B7-1抗体通过抑制B7-1/CD28信号通路下调机体的免疫应答,减少自身抗体的产生,对自身免疫造成的病理损伤具有逆转作用。

^(99)Tc^m-抗人膀胱癌-人鼠嵌合抗体在荷人膀胱癌裸鼠的放射免疫显像

目的 研究99Tcm 抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体ch BDI对膀胱癌细胞的体外结合性能、在荷人膀胱癌裸鼠中的体内分布及对肿瘤的靶向定位性能。方法 用改进的Schwarz方法进行99Tcm 标记 ,经SephadexG 5 0柱分离纯化。用纸层析法测定标记率与放化纯 ;用Lindmo的方法测定免疫活性分数 ;用Scatchard作图法求得亲和常数。荷人膀胱癌裸鼠静脉注射99Tcm ch BDI 11.1MBq(30 μg) ,分别于 2、6、2 0及 2 4h行放射免疫显像。用感兴趣区 (ROI)技术获得全身和肿瘤放射性计数及肿瘤与对侧正常组织 (T NT)的放射性比值。 2 4h显像后处死裸鼠 ,测定体内放射性分布 ,计算每克组织百分注射剂量率 (%ID g)及T NT比值。结果 99Tcm ch BDI标记率为 (6 6 .5± 7.3) % ,放化纯 >90 % ,免疫活性分数为 76 % ,亲和常数为 3.5 6× 10 9L mol。荷人膀胱癌裸鼠放射免疫显像结果示 ,静脉注射后 6h肿瘤显影清晰 ,随时间延长更清晰。全身放射性计数随时间延长迅速降低 ,肿瘤放射性计数下降缓慢 ,T NT比值随时间增高。荷瘤裸鼠体内分布结果示 ,静脉注射后 2 4h肿瘤 %ID g为 17.4 ,除肾脏外 ,肿瘤与其他正常组织有很高的T NT比值 ,与脑、肌肉、小肠壁、骨骼及心壁的T NT比值分别为 136 .0、5 5 .1、39.3、2 9.7及 2 7 9。结论 ch BDI具有良?

抗CD4人-鼠嵌合抗体的鉴定及对PBMC增殖反应的影响

目的对已构建表达的抗 CD4人 -鼠嵌合抗体的生物学特性进行鉴定 ,比较嵌合抗体与鼠源性单抗对抗 CD3Mc Ab和 EBV转化细胞诱导的外周血单个核细胞 (PBMC)增殖反应的影响 ,以探讨抗 CD4抗体的增殖抑制作用机制。方法采用间接免疫荧光竞争抑制实验比较两种抗体对 CD4抗原的相对亲和力 ,MTT法检测抗 CD4抗体的增殖抑制作用。结果转染瘤细胞具有稳定表达及分泌特异性抗 CD4人 -鼠嵌合抗体的能力 ;两种抗体对 CD4抗原的相对亲和力相同 ;对经 TCR途径刺激诱导的 PBMC增殖反应均有抑制作用 ,嵌合抗体的增殖抑制作用较鼠源性单抗强。结论抗 CD4抗体的抑制作用很大程度上直接作用于 TCR诱导的活化信号。

抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究

目的 对抗 CD71人 -鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究。方法 以表达 CD71分子的 3种人类肿瘤细胞( K5 62 ,CEM和 SMMC- 772 1)为靶细胞 ,以正常人外周血单个核细胞 ( PBMC)为效应细胞 ,在效 /靶细胞比为 5 0∶1的条件下 ,测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应 ( ADCC) ;以 CEM和 SMMC- 772 1为靶细胞 ,在有新鲜补体存在下 ,测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应 ( CDC)。结果 抗 CD71人 -鼠嵌合抗体 ( D2 C)能够通过识别 CD71分子 ,并通过人抗体 Fc段介导 ADCC。在有新鲜补体存在下 ,介导 CDC。结论 抗 CD71人 -鼠嵌合抗体对 CD71+肿瘤细胞可介导 ADCC和 CDC。

分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性与稳定性的研究

目的 研究在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性、稳定性及抗体产量。方法 利用人IgG和鼠IgG作为浓度标准 ,绘制浓度曲线 ,比较研究转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。腹腔接种转染瘤细胞诱导裸鼠产生腹水抗体 ,经离子交换法纯化 ,电泳鉴定纯化嵌合抗体。结果 1× 10 5个 5ml转染瘤细胞培养 5天的上清中 ,嵌合抗体分泌量为 (0 .5～ 5 ) μg ml。Balb c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 (3～ 5 )ml,腹水抗体经纯化 ,抗体产量约为 (1～ 2 )mg (ml腹水 )。经离子交换法纯化 ,电泳鉴定 ,在分子量 5 5kDa和 2 5kDa处 ,可见有抗体IgG蛋白质的重链和轻链的染色条带。结论 由我们制备的在液氮中冻存 2年的分泌抗CD71人 鼠嵌合抗体 (D2C)的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,产量高 ,特异性强。

抗人p185^(erbB2)人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定

目的 :HER2 /neu过度表达见于多种恶性肿瘤。作为肿瘤抗原 ,p185 erbB2 是一个理想的肿瘤治疗靶点。本实验在既往工作基础上 ,构建嵌合型抗p185 erbB2 单克隆抗体 (单抗 )的真核表达载体 ,并在CHO dhfr-细胞中表达 ,从而降低鼠源性抗体的免疫原性 ,为进一步的应用研究奠定基础。方法 :RT -PCR扩增p185 erbB2 单抗 1 2的轻、重链可变区基因 ,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中 ,脂质体转染CHO dhfr-细胞。经RT -PCR、间接ELISA、Westernblot检测人 -鼠嵌合抗体的表达水平 ,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定。此外 ,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用。结果 :用RT -PCR、间接ELISA、Westernblot方法证明人 -鼠嵌合抗体在CHO dhfr-细胞中表达 ;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185 erbB2的细胞反应阳性 ,与低表达p185 erbB2 的细胞反应阴性 ;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185 erbB2 分子特异性结合 ;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用。结论 :CHO dhfr-细胞表达的人 -鼠嵌合抗体可与p185 erbB2 特异性结合 ,并可抑制高表达p185 erbB2 的肿瘤细胞生长 ,表明抗人p185 erbB2 人

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因，经核苷酸序列分析，轻链变区基因为３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸；重链变区基因为３５１ｂｐ，编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒，经一系列克隆、筛选，得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ，用霉酚酸进行初步筛选，最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆，免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样肾炎的免疫干预效应

目的探讨在诱导c GVHD小鼠狼疮样肾炎模型并通过各项指标鉴定其造模成功的基础上,运用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/CD28共刺激信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法将6~8周龄雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠随机分为4组,模型组于0、3、7和11 d经眼眶静脉注射100μL雌性亲代BALB/c小鼠脾脏细胞107/只。抗体干预组在造模后第1、3、5、8、15、30及60天分别经眼眶静脉注射100μL B7-1人-鼠嵌合抗体(克隆号2B11)200μg/只,环磷酰胺(CTX)干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15天分别腹腔注射100μL CTX 2.5 mg/只。按照上述时间点分析小鼠抗ds DNA抗体、ANA及尿蛋白含量,12周时处死小鼠观察肾脏组织HE染色、免疫复合物(IC)沉积等情况。结果模型组100%小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为++^++++,抗体干预组12周时仅有30%的小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为+^++;12周时与模型组相比,抗体干预组小鼠血清抗ds DNA抗体阳性率由50%降至0;抗体干预组ANA阳性率由90%降至40%,且荧光面积与荧光亮度均下降;HE染色镜下观察,抗体干预组肾小球囊腔大小较为均一,炎性细胞浸润减少;直接免疫荧光法可见抗体干预组肾小球血管襻IC沉积减少。结论 B7-1人-鼠嵌合抗体可通过阻断或削弱B7/CD28共刺激信号通路,减少自身抗体和IC生成,逆转狼疮肾炎的病理损伤,提示该自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体对狼疮肾炎具有潜在的防治作用。

鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因的表达

目的 制备抗人转铁蛋白单链抗体。方法 拼装好并带有酶切位点粘性末端的鼠抗人转铁蛋白的单链抗体基因经凝胶电泳定量后,同载体pCANTAB 5E连接,以其转化E.coli TG1细胞,经辅助噬菌体M13K07挽救构建噬菌体抗体表面呈现文库、抗原包被固相材料富集选择阳性重组噬菌体克隆（Panning）。感染能产生可溶抗体片段的大肠杆菌菌株E.coli HB2151,制备可溶抗体,以Anti-E末端抗体进行Western blot、ELISA检验和分子量测定。结果 人转铁蛋白的单链抗体基因成功表达。结论 用基因工程抗体技术制备抗体是可行的。

抗人整合素ανβ_3 单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。

6C6鼠-人嵌合抗体的纯化及鉴定

采用基因工程技术 ,将小鼠 6C6单克隆抗体可变区基因与人抗体恒定区基因连接 ,构建了鼠 人 6C6嵌合抗体基因 ,并在CHO细胞中高效表达 .利用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化 6C6嵌合抗体 ,得到电泳纯度大于 98%的 6C6嵌合抗体 ,其重链 (5 5kD)和轻链 (2 4kD)符合IgG相对分子质量的理论值 .Western印迹、细胞免疫荧光和免疫组织化学实验结果均呈阳性 .表明6C6嵌合抗体可识别人乳腺癌细胞表面上的肿瘤相关抗原 ,保持了 6C6单克隆抗体的特性 。