鼠李糖乳杆菌对老年小鼠术后海马区小胶质细胞激活及Tau蛋白磷酸化的影响

【目的】探讨术前益生菌鼠李糖乳杆菌(LGG)灌胃对麻醉手术老年小鼠海马区小胶质细胞及Tau磷酸化的影响。【方法】18月龄C57BL/6J小鼠30只随机分为3组,10只/组:对照组,麻醉手术组,麻醉手术+鼠李糖乳杆菌组。生理盐水/LGG 109CFU 150μL灌胃,每日1次,连续20 d后接受异氟醚麻醉+剖腹探查手术,术后12 h免疫荧光染色检测海马区小胶质细胞激活状态,ELISA检测IL-6的浓度变化,Western blot检测Tau蛋白磷酸化位点Tau-pS202/pT205和total Tau蛋白表达变化。【结果】对照组海马区小胶质细胞呈静息状态,炎症因子IL-6浓度为(82.08±12.07)pg/mL。与对照组相比,麻醉手术组海马区小胶质细胞活化增生,胞体变大,突起缩短变粗,炎症因子IL-6上升至(123.7±5.72)pg/mL(P=0.000),磷酸化Tau-pS202/pT205蛋白表达量也明显增加(P=0.002)。而与麻醉手术组相比,麻醉手术+LGG组海马区小胶质细胞增生肥大不明显,炎症因子IL-6分泌减少至(96.68±9.59)pg/mL(P=0.008),磷酸化Tau-pS202/pT205蛋白表达量明显下降(P=0.002)。而3组total Tau蛋白表达水平差异无统计学意义。【结论】术前服用益生菌鼠李糖乳杆菌减轻麻醉手术导致的老年小鼠海马区小胶质细胞活化、炎症因子分泌增加、以及Tau蛋白磷酸化水平增加。

鼠李糖乳杆菌发酵中药制剂条件优化及对鸡球虫感染的疗效试验

为探究鼠李糖乳杆菌发酵中药组方(青蒿、常山、仙鹤草、何首乌、白头翁及白茅根)制剂的最佳条件及其对感染球虫鸡存活率、血便计分、每克粪便卵囊数(OPG)及免疫细胞等的影响,试验筛选了鼠李糖乳杆菌发酵中药组方制剂的最佳中药浓度、接菌量、培养时间和pH值。用在该条件下发酵的中药制剂对正阳三黄鸡进行抗球虫感染试验,试验鸡分为空白对照组、球虫攻毒组、地克珠利组、纯中药组、鼠李糖乳杆菌发酵中药组及鼠李糖乳杆菌组;21日龄时分别称量各试验组鸡的体重,计算存活率、OPG值及检测血便记分与血液中的CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞含量。结果显示:中药浓度为1.5 g/mL、接菌剂量为2%、培养时间为18 h、pH为6.5时,鼠李糖乳杆菌活性最高;鼠李糖乳杆菌发酵中药组试验鸡21日龄体重和14~21日龄平均日增重显著高于球虫攻毒组、纯中药组和鼠李糖乳杆菌组(P<0.05);鼠李糖乳杆菌发酵中药组血便记分和OPG值显著低于球虫攻毒组、纯中药组和鼠李糖乳杆菌组(P<0.05);鼠李糖乳杆菌发酵中药组CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞含量显著高于球虫攻毒组、纯中药组和鼠李糖乳杆菌组(P<0.05)。研究表明,鼠李糖乳杆菌有最佳的发酵中药条件,该条件下发酵的中药制剂能够在防治球虫感染鸡方面能够提高鸡的存活率、减少血便及卵囊排出,提高鸡CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞含量,并且比单独的中药组方及单独的鼠李糖杆菌具有明显优势。

鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12对克林霉素诱导小鼠肠道菌群紊乱的影响

为探讨鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12对小鼠肠道菌群的影响,将60只BALB/c小鼠适应性喂养1周后,随机分成对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。其中对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水,模型组灌胃克林霉素和同体积生理盐水,受试组分别按照1.5×10^(6)、1.5×10^(7)、1.5×10^(8)CFU/只灌胃鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12。灌胃14 d后,测定小鼠体质量、肠道菌群结构、组织病理变化、肠道屏障功能、肠道通透性和短链脂肪酸浓度。结果表明,与对照组相比,鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12使小鼠粪便中乳杆菌、双歧杆菌等有益菌的数量显著提高,产气荚膜梭菌的数量显著下降,并且短链脂肪酸的浓度明显提高。鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12对调节小鼠肠道菌群具有显著的改善作用。

6株鼠李糖乳杆菌的安全性评价

鼠李糖乳杆菌具有多种益生性能,广泛应用于多个行业,但菌株的安全性具有个体差异。本研究通过对实验室保存的6株鼠李糖乳杆菌进行溶血性、有害代谢产物、抗生素耐受性、小鼠急性毒性试验进行菌株的安全性评价,同时进行6株鼠李糖乳杆菌的抑菌性能试验。试验结果显示,所选用的6株鼠李糖乳杆菌均无溶血活性,不会产生氨基酸脱羧酶和吲哚,不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐;会产生少量的D-乳酸,含量均低于0.0600μmol/mL,其中0479产D-乳酸最少,为0.0395μmol/mL;0463、0465、0479菌株对红霉素、氯霉素、氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、链霉素均敏感;对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌具有一定的抑制能力,抑菌圈直径在9.75 mm以上;小鼠急性毒性试验结果表明,6株鼠李糖乳杆菌对小鼠安全、无毒副作用。综上所述,所测试的6株鼠李糖乳杆菌安全性较高,为其应用奠定了基础。

鼠李糖脂的分离鉴定及其在食品中的应用研究进展

鼠李糖脂(rhamnolipids,RLs)是一种天然的具有多种生物活性的脂类物质,由于其具有促进发酵起泡、抑制细菌生物膜形成和调节免疫等功能,可广泛应用于食品、医药和农业等领域。目前工业上已经采用微生物发酵法对RLs进行生产制备。RLs作为最有前途的商业化生物表面活性剂,高效、准确的鉴定和表征RLs对其生产、应用至关重要。本文介绍了RLs的生产方法 ,重点概述RLs的分离纯化工艺和鉴定技术,并总结了RLs在食品领域的应用现状,为今后RLs活性开发及应用提供参考,推动其在食品领域的工业化进程。

鼠李糖乳杆菌利用不同益生元的增殖及耐受性研究

作者旨在通过对比鼠李糖乳杆菌(Lactiplantibacillus rhamnosus)与不同益生元组合后,在生长情况、pH和胆盐耐受性及乳酸产量方面的变化筛选出鼠李糖乳杆菌与益生元的最佳组合。结果表明,鼠李糖乳杆菌GG(L.rhamnosus GG,LGG)、鼠李糖乳杆菌HN001在以低聚半乳糖为唯一碳源生长时,最大生物量分别为1.253、1.552,最大比生长速率分别为0.316、0.290 h^(-1),乳酸产量分别为3.654、10.914 g/L,与其他益生元组合相比,表现出显著优势。为验证这两种组合在不同胁迫条件下的生长情况,进一步测定了其在不同pH和胆盐质量浓度下的耐受性。这两种组合在1 g/L胆盐条件下的最大生物量分别为0.712和0.694,在pH 4.0条件下的最大生物量分别为0.639和0.728,与其他组合相比存在极显著差异。该研究结果有助于推动鼠李糖乳杆菌与低聚半乳糖组合在食品、医疗等领域的广泛应用,为后续益生菌-益生元组合产品的开发提供了理论依据。

鼠李糖脂抑制芽孢态蜡样芽孢杆菌的活性及机制

以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)芽孢为研究对象,从表观、形态和胞膜状态等方面解析鼠李糖脂(rhamnolipids,RLs)对芽孢态B.cereus的抑制活性和作用机制。结果表明,RLs的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为80.0 mg/L和160.0 mg/L。两个浓度的RLs均可以引起芽孢表面出现严重的皱缩和凹陷,破坏芽孢细胞膜完整性和通透性,导致胞内电解质、DNA和蛋白质等生物大分子外泄。同时,RLs可以通过降低芽孢的耐热性、产生胞内氧化应激反应、降低表面黏附能力、结合并干扰DNA分子等多种抑菌机制对B.cereus芽孢起到抑制和灭活作用。研究结果有利于推动RLs在食品安全领域的开发和应用。

鼠李糖脂对污泥自热高温微氧体系有机碳源释放的影响

为探究表面活性剂在自热高温微氧(ATMAD)发酵体系中对有机碳源的释放会产生何种影响,选取鼠李糖脂(RL)这一无毒无害且易于获取的典型生物表面活性剂,依托ATMAD发酵体系,展开实验探究.结果表明,投加0.02~0.07g/gTSS鼠李糖脂对反应体系中污泥的溶解,可溶性有机物的释放及挥发性脂肪酸的积累有较为明显的促进作用,相关指标均有明显提高,产酸相关功能菌的丰度也有所增加,当投加量为0.07g/gTSS时,VFA累积浓度最高,为空白组的1.63倍,判断此时为最佳投放浓度;当投加浓度高于0.10g/gTSS时,会对有机碳源的释放产生抑制.在ATMAD体系中添加适量鼠李糖脂对于开发优质外加碳源这一工作具有较高的可行性.

鼠李糖乳杆菌对高龄妊娠大鼠肠道菌群及子代的影响

目的:探究鼠李糖乳杆菌(LGG)对高龄孕鼠肠道菌群及其子代的影响。方法:选取3月龄SD雌鼠(非高龄)10只、12月龄SD雌鼠(高龄)8只与3月龄SD雄鼠以2∶1比例合笼。将交配成功的雌鼠分为4组:非高龄对照组(NMA.C组)、非高龄干预组(NMA.E组)、高龄非干预组(AMA.C组)、高龄干预组(AMA.E组)。对照组及非干预组予生理盐水0.25mL/d灌胃,干预组予LGG制剂1×10^(9)CFU/(0.25mL·d)灌胃,连续14d,灌胃后收集孕鼠的粪便、血清及胎盘组织。结果:与高龄非干预组相比,高龄干预组胎盘组织超氧化物歧化酶(SOD)活性升高,孕鼠血清促炎细胞因子IL-6、TNF-α降低,抗炎细胞因子IL-10升高。高龄干预组的乳酸杆菌目、乳酸杆菌科丰度显著高于高龄非干预组,而高龄非干预组中梭菌纲丰度显著增高;高龄干预组的子代数量及身长均显著增加。结论:孕期补充鼠李糖乳杆菌可提高孕鼠抗氧化水平,减少炎症反应;增加孕鼠肠道菌群的物种丰富度和均匀度,增加有益菌的丰度,降低致病菌的丰度,改善高龄孕鼠的肠道菌群紊乱。

鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平快速定量方法的建立及应用

目的应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR),建立鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的快速定量检测方法。方法通过比对鼠李糖乳杆菌HN001的近缘菌株的基因组,筛选出鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的特异基因,以菌株水平的特异基因为靶标设计引物及探针,优化反应体系和条件,建立鼠李糖乳杆菌HN001株水平的qPCR检测方法。对方法的特异性、灵敏度、检出限进行验证,并采用已建立的qPCR方法进行模拟添加样品和实际样品的检测。结果所建立的方法特异性强,与近缘菌株无交叉反应,鼠李糖乳杆菌HN001纯培养液检出限为10^(2)CFU/mL,灵敏度可达到650 copies/μL,可在2 h内完成样品检测。对模拟添加样品以及实际样品检测中qPCR和平板计数法结果的对数值进行显著性分析检验,两种方法的测定值结果均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的qPCR检测方法可有效应用于益生菌产品中鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平定量检测,具有快速、灵敏、准确的特点。

鼠李糖乳杆菌细菌素WO-A/2的表达及其抗菌特性

为建立鼠李糖乳杆菌细菌素替抗、防腐应用平台,探究鼠李糖乳杆菌细菌素的抗菌特性,利用DNASTAR软件对鼠李糖乳杆菌细菌素进行全基因序列分析,确定了鼠李糖乳杆菌细菌素的主要调控基因为wo-a/2,利用原核表达的方法表达细菌素WO-A/2,并对WO-A/2的可溶性、诱导表达条件、免疫原性、溶血活性、抑菌特性进行了分析。结果表明,作者成功构建了pET-32a-wo-a/2质粒,表达了鼠李糖乳杆菌细菌素WO-A/2,其主要以包涵体的形式存在。当表达pET-32a-wo-a/2质粒的菌株接种于含Amp^(+)的LB液体培养基中培养,以终浓度1.0 mmol/L的IPTG诱导8 h后,细菌素WO-A/2的表达量最大。通过双层牛津杯血琼脂平板法验证表明,不同浓度的鼠李糖乳杆菌细菌素WO-A/2均无溶血活性。采用双荧光染色法,通过激光共聚焦显微镜观察到细菌素WO-A/2可促使金黄色葡萄球菌凋亡。该研究为鼠李糖乳杆菌细菌素成为安全可靠的生物替抗剂提供了依据。

鼠李糖乳酪杆菌GloryLG12对小鼠肠道健康的影响

为探究鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)Glory LG12对肠道健康的影响,通过给小鼠灌胃鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12,对小鼠肠道微生物计数并测定其主要代谢物短链脂肪酸,观察小鼠肠道组织形态及肠道通透性,测定小鼠肠道上皮细胞紧密连接蛋白和黏蛋白相关基因相对表达量,综合评估菌株对小鼠肠道健康影响。结果表明,中剂量(1.6×10^(7)CFU·只^(-1))和高剂量(1.6×10^(8)CFU·只^(-1))鼠李糖乳酪杆菌GloryLG12可增加小鼠体重,提高小鼠肠道内部分有益菌(双歧杆菌、乳杆菌)数量,降低肠道内部分有害菌(产气荚膜杆菌)数量,且增加肠道内短链脂肪酸含量。灌胃鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12不会对小鼠肠道组织造成病理学损伤,还可提高小鼠肠道屏障完整性,降低肠道通透性。由此表明,鼠李糖乳酪杆菌Glory LG12对调节小鼠肠道微生态具有一定的益生作用。

大豆分离蛋白和大豆肽对鼠李糖乳杆菌GG生长代谢的影响

为探究氮源类营养物质对鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)生长和代谢的影响,本研究以模拟胃肠道消化后的大豆分离蛋白和大豆肽为原料,通过单培养的方式分别测定鼠李糖乳杆菌GG的活菌数和乳酸及乙酸产量,并将鼠李糖乳杆菌GG与单增李斯特菌共培养测定其在致病菌存在下利用大豆蛋白和大豆肽的情况。结果表明,在单培养的条件下消化后大豆分离蛋白和大豆肽都能显著提高鼠李糖乳杆菌的活菌数(P<0.05),而消化后大豆肽的作用比消化后大豆蛋白的作用提前4 h,且二者都能显著提高乳酸和乙酸的生成(P<0.05)。在共培养体系中,消化后大豆蛋白显著削弱了单增李斯特菌的竞争能力,提高了鼠李糖乳杆菌的竞争能力,且培养4 h和8 h后,鼠李糖乳杆菌的活细胞数显著高于单培养(P<0.05)。本研究结果将氮源作为具有潜在益生功能的营养物质,为消化后大豆蛋白和大豆肽功能性食品的开发提供理论依据。

低聚糖对鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的选择性促进作用

选择3株婴幼儿食品中应用的商业菌株(鼠李糖乳杆菌MP108、GG和动物双歧杆菌Bb-12)以及2株母乳源益生菌(鼠李糖乳杆菌M53和植物乳杆菌AUH2103)为试验对象,研究益生菌对低聚糖的利用能力,并探究低聚糖对益生菌的选择性促进作用。结果表明:低聚果糖及低聚半乳糖能显著促进植物乳杆菌AUH2103的生长,鼠李糖乳杆菌MP108、GG、M53及动物双歧杆菌Bb-12对低聚果糖、菊粉、2’-岩藻糖基乳糖、低聚木糖利用能力较弱,但对低聚半乳糖利用能力均较强,其中鼠李糖乳杆菌MP108的利用能力最强。以植物乳杆菌AUH2103和鼠李糖乳杆菌MP108进行混菌培养,与普通MRS相比,在低聚糖MRS培养基(尤其是低聚果糖MRS)中,植物乳杆菌AUH2103生长优势更为显著;当低聚果糖为唯一碳源时,植物乳杆菌AUH2103与鼠李糖乳杆菌MP108的活菌数比值高达41。添加低聚糖能显著缩短植物乳杆菌AUH2103和鼠李糖乳杆菌MP108发酵乳的凝乳时间,并提高凝乳酸度;在低聚糖发酵乳中植物乳杆菌AUH2103的活菌数显著高于鼠李糖乳杆菌MP108。综上,低聚糖的添加在混菌培养时能更大程度地提高植物乳杆菌AUH2103的繁殖能力,低聚糖对不同益生菌同样存在选择性促进作用。

鼠李糖乳杆菌GG对大鼠脂多糖应激下抗氧化能力、免疫功能和肠道健康的影响

试验旨在探究鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)对SD大鼠生长性能及脂多糖(LPS)应激条件下抗氧化能力、免疫功能和肠道健康的影响。选取24只体重、日龄相近的健康雄性SD大鼠,前期随机分为对照组(CON组)和LGG组,每组6个重复,每个重复2只。LGG组大鼠每日灌胃1×10^(8) CFU/mL LGG 2 mL,CON组灌胃等量生理盐水,连续灌胃15 d。试验第14天,分别从CON组和LGG组每个重复中随机挑选1只大鼠,按体重腹腔注射2 mg/kg LPS溶液,分别命名为LPS组和LGG+LPS组,剩余大鼠注射等量无菌生理盐水。大鼠麻醉后解剖,采集血清、回肠,检测抗氧化指标、炎症因子水平以及回肠形态。结果表明:与CON组相比,LGG组料重比有降低趋势(0.05≤P<0.10);LPS应激导致大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量显著升高(P<0.05),总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量显著下降(P<0.05),而在LPS应激下LGG预处理可显著降低血清中ALT、AST、IgA、IgG、IgM、IL-1β、IL-8和TNF-α含量(P<0.05),显著提高ALB和TP含量(P<0.05);此外,LPS应激还导致血清和回肠黏膜过氧化氢酶(CAT)含量和总抗氧化能力(T-AOC)显著下降(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著上升(P<0.05);在LPS应激下LGG预处理可显著提高血清和回肠黏膜CAT含量及回肠黏膜T-AOC(P<0.05),显著降低血清和回肠黏膜MDA含量(P<0.05);各组间大鼠肝脏、胸腺和脾脏指数以及回肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度均无显著差异(P>0.05)。综上所述,LPS应激诱导大鼠肝脏损伤、氧化应激及免疫应激,LGG预处理可在一定程度提高大鼠饲料转化率,通过提高机体本身抗氧化功能、免疫功能预防和缓解LPS应激产生的负面作用。

一株具有降血糖功能的鼠李糖乳酪杆菌RH0121筛选及其益生特性研究

以商业菌株鼠李糖乳酪杆菌LGG作为阳性对照,从婴儿粪便中筛选出具有良好抑制α-葡萄糖苷酶和较好耐逆性能力的菌株。结果显示,14株菌种中HCS0053、RH0121、RE2153、RH44844株菌对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制作用,其抑制率分别为29.46%、31.49%、30.10%、29.43%,其中菌株RH0121可同时抑制α-淀粉酶的活性。经过对菌株RH0121的形态特征、生理生化特性研究及16S rDNA检测,鉴定该菌株为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)。测定鼠李糖乳酪杆菌RH0121的耐逆性,其耐酸、耐胆盐及在胃液条件下有较高的存活率。鼠李糖乳酪杆菌RH0121为具有良好的胃肠液耐受能力的潜在降血糖功能菌株。

鼠李糖乳杆菌对新生儿坏死性小肠结肠炎保护作用的研究进展

新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis of newborn,NEC)是导致新生儿死亡的主要疾病之一。研究认为,NEC与肠道菌群失调、肠上皮屏障功能改变、肠道炎症、肠黏膜脂多糖激活Toll样受体4等有关。目前,临床对NEC尚无有效治疗措施。益生菌在NEC的预防和治疗中所发挥的作用得到人们越来越多的认可。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)是当前研究较为广泛的益生菌之一,其已被应用于多种胃肠道微生态失调相关疾病的预防和治疗中。本文就LGG在NEC的预防和治疗中的相关机制研究进展作一综述,以期为其临床应用提供理论支持。

鼠李糖硅烷醇促进HPR渗透吸收的研究

通过体外经皮渗透和细胞实验,探讨了鼠李糖硅烷醇对羟基频哪酮视黄酸酯(HPR)的协同增效作用。在透皮试验中证明了鼠李糖硅烷醇对HPR具有促渗透的效果,与对照组相比,在皮下检测到的HPR含量明显增高;在基因RARg和RBP1的表达测试中,结果显示含10%鼠李糖硅烷醇溶液对HPR具有功效增强的效果,基因表达较对照组明显提升。由此可见,鼠李糖硅烷醇对HPR在皮肤透皮吸收中具有促进作用,可以进一步应用到抗衰老化妆品配方技术中。

鼠李糖脂协同氮磷共改性活性炭/过一硫酸盐体系去除地下水中氧氟沙星

本研究制备了一种非金属高效催化剂——氮磷共改性活性炭(NPAC),利用鼠李糖脂增强NPAC在多孔介质中的迁移能力和分散性,促进NPAC/过一硫酸盐(PMS)体系去除地下水中氧氟沙星;探究NPAC剂量、PMS浓度、氧氟沙星浓度、达西流速对NPAC/PMS体系去除氧氟沙星的影响。结果表明,在鼠李糖脂的协同作用下,NPAC/PMS体系在多孔介质环境中适用性较广,氧氟沙星的最高去除率达到84.30%。

鼠李糖脂润湿煤尘表面特性研究

本文以鼠李糖脂为例,测试生物表面活性剂在煤尘治理方面的应用。从表面张力、接触角、沉降时间试验着手,分析不同质量浓度下鼠李糖脂溶液的表面性能与润湿性能,确定鼠李糖脂溶液的最佳润湿浓度,并结合傅里叶红外光谱试验分析鼠李糖脂对煤体微观结构特性的影响,最终借助自行搭建的模拟巷道平台测定鼠李糖脂的降尘效率。试验结果表明:生物表面活性剂——鼠李糖脂具备用作煤尘抑尘剂的基本性能。鼠李糖脂的加入不仅降低了清水的表面张力、接触角及沉降时间,且全尘、呼尘降尘效率分别达到了79.11%,74.93%,同比清水提升了41.5%、42.48%,抑尘效果显著。综合成本因素,确定鼠李糖脂溶液的最佳润湿浓度为0.04%,红外光谱分析表明,羟基及含氧官能团含量变化是影响煤体润湿的关键因素。