鼠李糖乳杆菌LGG细胞壁蛋白的预测和功能分析

[目的]采用生物信息学方法预测鼠李糖乳杆菌LGG细胞壁蛋白和功能分析。[方法]以鼠李糖乳杆菌LGG基因组编码蛋白序列为研究对象,采用Phobius和Signal P 4.0软件分析该菌株的细胞壁蛋白,同时采用COG功能数据库对预测的细胞壁蛋白进行功能分析。[结果]鼠李糖乳杆菌LGG基因组中含有41个细胞壁蛋白,这些蛋白的功能分析结果显示,41个细胞壁蛋白中,25个蛋白没有功能注释,16个有功能注释,主要与细胞壁和细胞膜的生物合成,碳水化合物的代谢与转运,蛋白质的翻译后修饰等功能有关。[结论]该研究从结构和功能上分析鼠李糖乳杆菌细胞壁蛋白,为分析益生菌适应环境的分子特征打下基础。

灌胃和腹腔注射鼠李糖乳杆菌对妊娠期小鼠粪便菌群多样性的影响

【目的】研究灌胃和腹腔注射鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus,LGG)对妊娠期小鼠粪便菌群多样性的影响,为动物妊娠期生理及肠道健康提供理论依据。【方法】选择体重相近(23.33 g±1.55 g)、配种日期相同的SPF级妊娠昆明小鼠45只,随机分为3组,分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组15只。在相同饲养管理和饲粮营养水平下,从妊娠的第2天开始,对照组饲喂基础饲粮;试验Ⅰ组腹腔注射0.5 mL含有0.125 g LGG的灭菌生理盐水(连续14 d);试验Ⅱ组灌胃0.5 mL含有0.125 g LGG的灭菌生理盐水(连续18 d),试验期21 d。所有小鼠于临产前1 d解剖,采集大肠粪便样品,提取各组粪便样本的基因组DNA,PCR扩增后进行文库构建,对合格文库应用NovaSeq 6000测序平台进行测序,采用Uparse软件(v 7.0.1001)以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(OTUs)并筛选代表序列。采用Mothur方法与SILVA 132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析,并统计门、科和属水平上的群落组成。使用QIQME 1.7.0软件进行Alpha多样性分析,计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数,并进行LEfSe分析,利用FAPROTAX预测肠道菌群的功能。【结果】与对照组相比,试验Ⅱ组Chao1和ACE指数显著升高(P<0.05),试验Ⅰ和Ⅱ组小鼠Simpson指数降低(P>0.05)。与对照组相比,在门水平上,试验Ⅰ和Ⅱ组厚壁菌门升高;试验Ⅰ组变形菌门升高,试验Ⅱ组变形菌门降低;在科水平上,试验Ⅰ和Ⅱ组的毛螺菌科、乳酸菌科、韦荣球菌科和脱硫弧菌科升高;在属水平上,试验Ⅰ和Ⅱ组的乳酸杆菌属和未确定毛螺菌科属均升高。LEfSe分析结果显示,对照组有2种显著性的菌;FAPROTAX预测出35种肠道菌群的功能。【结论】在本试验条件下,灌胃LGG能够显著提高Chao1和ACE指数,且灌胃LGG组OTUs数量高于腹腔注射组;灌胃组小鼠厚壁菌门/拟杆菌门的比值、变形菌门、脱硫弧菌科和乳酸杆菌属较腹腔注射组降低,未确定毛螺菌科属升高。综合比较两种补喂方式,给妊娠小鼠灌胃LGG对妊娠期健康有促进作用。

鼠李糖乳杆菌GG(LGG)高密度培养基优化

鼠李糖乳杆菌GG是国家认可的第3代益生菌的一种,因其可在肠道定植并且有耐酸碱等特性而得到广泛应用。实验希望优化其培养基,使鼠李糖乳杆菌GG能用较低的成本来进行高密度培养。首先以MRS培养基为基础,根据物种特性进行碳源(麦芽糖:葡萄糖:乳糖:蔗糖)、氮源(胰蛋白胨:牛肉膏:酵母粉)和增菌物质(黄瓜汁:西红柿汁)的成分分别调整,之后进行单因素分析。在相同的条件下,经过37℃厌氧、恒温培养16 h后,测OD600来比较增菌效果。实验发现胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、西红柿汁这4种物质增菌明显。在以上述4种物质设计4因素3水平L9(34)的正交分析,结果为鼠李糖乳杆菌GG影响性西红柿汁>胰蛋白胨>葡萄糖>酵母粉,其中最佳配比方案为A3B1C3D2(2.5%胰蛋白胨+1.5%酵母粉+2.5%葡萄糖+20%西红柿汁)。在优化配方下鼠李糖乳杆菌GG可达9.4×109cfu/mL。

鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统的构建

为了比较不同锚钩蛋白基序结合活性,构建新型的鼠李糖乳杆菌颗粒表面展示系统。首先,用热酸处理法制备鼠李糖乳杆菌GEM(Gram-positive enhancer matrix,GEM)颗粒,并通过电镜观察、RT-PCR检测和SDS-PAGE检测鉴定其处理效果;同时,利用大肠杆菌表达了锚定蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP并将其与GEM颗粒共同孵育结合;最后,使用免疫印迹、电镜观察、荧光显微镜观察和荧光分光光度法评价鼠李糖乳杆菌GEM颗粒与锚定蛋白的结合效率。结果表明,使用10%的TCA处理鼠李糖乳杆菌得到了灭活的肽聚糖骨架(GEM颗粒),经鉴定其大小形态均一,绝大部分无蛋白残留,3.8×10~6个GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为32;免疫印迹和荧光显微镜观察均可检测到融合蛋白PA3-EGFP和P60-EGFP锚定在GEM颗粒上,且结合在GEM颗粒表面的锚定蛋白呈絮状。荧光分光光度计法检测结果显示锚定蛋白PA3-EGFP结合GEM的效率稍高于P60-EGFP,但差异不显著(P>0.05)。以上结果表明由鼠李糖乳杆菌制得的GEM颗粒与锚定蛋白PA3、P60的结合效率良好,可用于构建新型的外源蛋白表面展示系统,进而为后续的细菌样颗粒疫苗的研究与应用奠定基础。