巴斯德毕赤酵母鼠李糖代谢基因LRA3功能及其启动子顺式作用元件的研究

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于具有遗传操作简单、重组蛋白高效分泌、高密度发酵和翻译后修饰等优点,常被用作表达宿主。其中基于甲醇诱导型强启动子P AOX 1的毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的表达系统,但该系统需使用易燃易爆有毒的甲醇作为诱导剂,极大地限制了其在食品酶和医药重组蛋白生产领域的应用,因而,开发无毒物质诱导的表达系统具有重要意义。前期研究预测了毕赤酵母鼠李糖代谢途径相关基因LRA 1~LRA 4,其中LRA 3启动子P LRA 3可实现重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达,但其在调控重组蛋白表达效果以及转录严谨性方面仍需进一步改进。基于此,通过敲除和回补实验证实了LRA 3参与毕赤酵母鼠李糖代谢途径,并采用方便易行的环化RNA反转录PCR(circularized RNA reverse transcription polymerase chain reaction,CRRT-PCR)确定了P LRA 3的转录起始位点,预测了与转录密切相关的元件。研究结果为后期启动子的理性改造提供了理论依据。