口蹄疫乳鼠毒在蚯蚓和苍蝇中实验带毒的研究

O型口蹄疫(FMD)乳鼠毒注射到蚯蚓(Pheretima sp.)体内后的第8天仍可检测到口蹄疫病毒(FMDV),但第14天以后则未查出。将此病毒洒在蚯蚓生活的土壤中,检测蚯蚓体内FMDV的结果亦同。本试验还间接地表明,FMDV不能在蚯蚓体内复制、增殖,蚯蚓只起携带FMDV的作用。蚯蚓属于低等动物,免疫系统尚未健全,但对非已物质有一定的免疫应答。蚯蚓与FMDV接触后,用间接血凝测得其体腔液中具有“抗体”反应。FMDV与舍蝇属(Muscasp.)和金蝇属(Chrysomyia sp.)的苍蝇接触24小时后,对其带毒检测结果表明:苍蝇只能短时在体表携带FMDV,且苍蝇体表携带FMDV的量很少。故认为在FMDV传播中苍蝇只起短时机械扩散作用。

减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin对肿瘤细胞糖酵解的影响

为进一步探讨重组减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin对肿瘤细胞糖酵解的影响,将重组减毒鼠伤寒沙门菌∆crp∆asdSL1344(pYA3493-SopE-Apoptin)和互补菌株∆crp∆asdSL1344(pYA3493-SopE)分别于体外感染黑色素瘤B16F10细胞,于感染后12 h和24 h收集细胞,检测细胞内丙酮酸、乳酸含量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的活性。结果显示,重组菌感染组能极显著下调丙酮酸含量(P<0.01);在感染24 h后,重组菌组乳酸含量极显著低于互补菌组和细胞对照组(P<0.01)。丙酮酸激酶和己糖激酶活性检测结果显示,重组菌组丙酮酸激酶活性和己糖激酶活性均显著低于互补菌组和细胞对照组(P<0.05)。以上结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin能抑制肿瘤细胞糖酵解的能力,通过下调丙酮酸和乳酸含量,降低丙酮酸激酶和己糖激酶活性,导致肿瘤细胞发生明显的代谢变化。

全栖息地毒鼠法及其应用

全栖息地毒鼠法以害鼠生态学为基础,将毒饵灭鼠三要素—杀鼠药物、用药技巧扣组织措施有机地结合,成为一套适合我国亚热带农业区防治鼠害的实用技术。本文阐述该技术6大环节即查明鼠情、选准时机、制好毒饵,组织围歼、正确投放和查漏扫残的技术要领与原理,並简介一些应用实例。

表达PRRSV GP3蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建

构建表达猪PRRSV GP3蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。将去信号肽序列的PRRSV ORF3基因插入到表达载体pYA3341(Asd+)中,构建重组质粒pYA3341-ORF3。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(Asd-、Cya-、Crp-),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF3)。体外鉴定重组菌表达的GP3蛋白、重组菌特性并进行小鼠免疫试验。酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳及Western blot检测有GP3特异性蛋白条带,小鼠免疫后可检测到GP3蛋白抗体。成功构建能稳定表达PRRSV GP3蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株。

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中 ,重组菌经LB固体及液体培养基连续传 15代后 ,单个菌落和菌液均呈绿色 ;在体内稳定试验中 ,经ICR小鼠连续传代 10次 ,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色 ,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS_PAGE结果显示 ,鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为 2 7kD ,这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后 ,观察 1个月未见有异常现象 ,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型 ,为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理提供了一个有力的工具 。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)。鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体。本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础。

减毒鼠伤寒沙门菌体内定位分析

分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况。将构建的红色荧光蛋白(RFP)原核质粒pYA33-DsRed,以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,重组菌命名为X4550(33-DsRed)。重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7和骨髓源树突状细胞(BMDC),并用流式细胞术检测红色荧光细胞荧光强度。此外,以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c小鼠,并于免疫后1d、2d、3d、5d、7d取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)细胞,检测各组织器官中的红色荧光阳性细胞百分率。重组菌对RAW264.7细胞和BMDC均具有良好的侵袭力。口服小鼠后,第1d,仅在MLN及PP中检测到RFP阳性细胞,其中PP中阳性细胞达到1.4%;第2d,在ILN中达到0.4%;第3d,各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势,此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞。第5d,RFP阳性细胞均减少,第7d则未检测到任何RFP阳性细胞。减毒鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力,其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位性,在优化黏膜疫苗以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用。

幽门螺杆菌尿素酶减毒鼠伤寒杆菌疫苗诱导小鼠黏膜免疫应答的研究(英文)

目的研究表达幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗口服免疫Balb/c小鼠后的黏膜免疫应答状况。方法将已构建成功的表达UreB的重组减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-Ureb口服免疫Balb/c小鼠，12周后检测肠液和血清中的特异性抗体反应。结果疫苗组小鼠胃黏膜炎症程度的差异无统计学意义。结论表达H.pylori UreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB能够诱导小鼠产生抗H.pylori的黏膜免疫，可用作抗H.pylori感染的口服疫苗。

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。

表达禽流感病毒特异性siRNA分子减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

为了寻找一种新的短干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）片段的表达和递送系统，并进行评价，根据禽流感病毒核苷酸序列，设计了3条分别针对A型禽流感病毒核衣壳蛋白、聚合酶A和H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性siRNA分子，人工合成相应DNA片段，退火后形成双链，与阴性对照片段分别连接到构建的pSIREN—ASD ZsGreen载体鼠源U6启动子下游，测序鉴定证实获得了阳性质粒，分别命名为PAZ—NP、PAZ-PA、PAZ—HA和PAZ-NC，1ng的质粒可以完全抑制50个PFU的禽流感病毒在MDCK细胞上的复制，细胞不产生任何病变，细胞上清的血凝效价为2^0，而对照组细胞在病毒感染36～48h后细胞变圆、死亡、脱落，其细胞上清的血凝效价可达2^4。将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到重组沙门氏菌X4550（PAZ—NP）、X4550（PAZ-PA）、X4550（PAZ—HA）和X4550（PAZ-NC）。对4日龄雏鸡口服1×10^9菌落形成单位（CFU）的重组菌后第1d、7d、15d用10。ELDso的H5亚型AIV进行攻毒，最后一次攻毒后观察15d，实验结束时采泄殖腔棉拭子对存活鸡进行病毒分离。结果表明，表达不同的siRNA分子对雏鸡有一定的保护力，保护率为27％～50％不等，存活鸡泄殖腔棉拭子未分离到病毒，说明重组减毒沙门氏菌携带质粒在体内产生的siRNA能够对机体产生一定保护力。

表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。 方法将ＮｃｏⅠ位点和ＭＧ７－Ａｇ模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的５′端。以含有ＨＢｃＡｇ全序列的质粒ｐ１．２Ⅱ为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因。将目的基因插入载体ｐＵＣｍ－Ｔ，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果序列测定证实，ＰＣＲ产物为胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体ｐＹＡ３３４１。重组质粒在Ｘ４５５０中的表达产物，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明，在相对分子质量（Ｍｒ）约在２２ ０００处有１条可与抗ＭＧ７ ｍＡｂ特异性结合的多肽表位。结论成功地研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的安全性与免疫效力

将运送 H5亚型高致病力禽流感病毒 DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)和 X4 5 5 0 (asd-p VAX1- HA )以 1× 10 1 0 CFU的剂量腹腔注射 1日龄 SPF白莱航雏鸡 ,结果表明 ,二者均具有良好的安全性。对 SPF白莱航鸡的免疫原性试验结果表明 ,这 2种细菌均能刺激鸡体产生高水平的肠道粘膜免疫应答 ,但是不能有效地激发血清抗体应答。对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫效力试验初步结果显示 ,X4 5 5 0 (asd- p VAX1- HA)免疫鸡能够抵抗强毒的攻击 ,保护指数为 77.8% ,而 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。

1株asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌作为核酸疫苗载体的构建与鉴定(英文)

目的利用载体-宿主平衡致死系统,将1株香港分离的野生型沙门氏菌(S129)构建为减毒核酸疫苗载体。方法以细菌生化反应和血清学方法鉴定S129为鼠伤寒沙门氏菌;以λ-RED同源重组方法靶向敲除S129株的asdA基因,并以卡那霉素抗性基因代替;通过菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌(asdAΔS129),在含2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid,DAP)或无DAP的LB培养基中培养,与野生株S129对比生长曲线以验证asdAΔS129构建的成功;以S129和asdAΔS129攻击BALB/c小鼠验证asdAΔS129减毒情况;结果菌落PCR鉴定得到阳性克隆,asdAΔS129必需外源性添加DAP方能生长;asdAΔS129不能致死BALB/c小鼠,得到成功的减毒;结论成功将1株野生型沙门氏菌构建成asdA缺陷型减毒核酸疫苗载体,并在体外和体内实验中验证,为下一步的疫苗呈递和肿瘤治疗实验提供了合适的载体。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组HBsAg口服疫苗构建与鉴定

采用大量培养含有pcDNA3s的大肠杆菌,提取pcDNA3s质粒,利用电转化方法将pcD-NA3s质粒转化到感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌,SDS-PAPG检测到930 bp大小的条带,基因序列分析到重组菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列;观察重组菌体外传代培养的稳定性,该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代。试验结果表明,携带HBsAg的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X8786/pcDNA3s已成功构建,为研究和应用人和动物治疗用乙型肝炎病毒口服基因工程活疫苗奠定了基础。

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学

用表达绿色荧光蛋白 ( green fluorescentprotein,GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 ( p YAGFP)给 BAL B/c小鼠尾静脉注射和口服 ,对小鼠脏器进行细菌计数 ,并用间接 EL ISA法测定血清中抗细菌的抗体。结果表明 ,静脉注射重组菌的小鼠在肝脏、脾脏中重组菌数量有 2个峰值 ,总的趋势是越来越少 ,而血清中抗体效价越来越高 ,可以初步推断 ,肝脏、脾脏中的细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ;口服重组菌的小鼠 ,在各脏器中重组菌的数量呈现正态分布的变化趋势 ,其中派伊尔结 ( Peyer′s patches,PPs)中细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ,而脾脏、肝脏及肠系膜淋巴结中细菌数量与血清中的抗体滴度无关。

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。