分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力

目的 :对鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及其保护力进行研究。方法 :PCR、化学转化及电穿孔法。结果 :采用PCR方法 ,特异地扩增了鼠疫菌F1抗原caf操纵子的 5Kb基因片段。将PCR产物与质粒载体连接后 ,经化学方法转化大肠杆菌LE392 ,获得caf基因克隆子 ,所得克隆子能较好地表达F1抗原基因。应用电穿孔法将克隆子的重组质粒转入鼠伤寒沙门氏菌G30内获得转化子 ,其F1抗原表达水平与在大肠杆菌LE392中的表达水平相同 ,反向血凝滴度可达 1∶80以上 ,与EV株相近。用该株免疫小鼠 ,2 0d后用 141株攻击 ,可延长平均死亡时间。结论 :caf基因的克隆子在鼠伤寒沙门氏菌G30中能够有效表达 ,且对小鼠显示出保护效果。

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原在酿酒酵母中的表达及鉴定

目的:构建含鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1的重组载体,并在酿酒酵母中表达。方法:将鼠疫杆菌的F1抗原结构基因caf1插入到pHSS6mTn3xHA/lacZ质粒中,构建重组载体pHSS6mTn3xHA/lacZcaf1。将重组载体经NotI酶切后,以醋酸锂法转化酿酒酵母,将转化的酿酒酵母接种于SCUra平板上筛选阳性克隆,表达产物用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:经SDSPAGE鉴定和Westernblot分析表明,转化的酿酒酵母可表达鼠疫杆菌F1表面抗原蛋白。结论:成功地构建了重组载体pHSS6mTn3xHA/lacZcaf1,并在酿酒酵母中稳定表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为制备可经消化道途径免疫的鼠疫杆菌基因疫苗奠定了基础。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

鼠疫菌F1抗体/抗原酶联免疫诊断试剂盒的应用评价

目的对兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒进行临床应用评价。方法采用双抗原/抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血球凝集试验(IHA)、胶体金免疫层析试验(GICA)3种方法的诊断试剂对比检测云南省地方病防治所中心实验室保藏的和现场采集的血清样品和脏器样品,对血清样品做鼠疫菌F1抗体检测,对脏器样品做鼠疫菌F1抗原检测。结果在358份血清样品中,ELISA试剂检出F1抗体阳性52份(14.52%),IHA试剂检出阳性37份(10.34%),GICA试剂检出阳性45份(12.57%)。ELISA与IHA试剂的符合率为95.23%,与GICA试剂的符合率为96.92%。经统计学χ2检验,ELISA试剂检出F1抗体阳性率高于IHA试剂(χ2=11.53,P=0.000 7),与GICA试剂检出的差异无统计学意义(χ2=3.27,P=0.070 4)。进一步分析滴度差值频数,ELISA试剂检测人血清的敏感性高于IHA试剂的样品占87.5%。在117份脏器样品中,3种试剂均检出F1抗原阳性15份(12.82%),符合率100%。滴度差值频数比较,ELISA试剂检测敏感性高于反向间接血球凝集试验(RIHA)试剂的样品为78.57%。结论兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒性质特异,其敏感性优于IHA试剂盒和GICA试剂条,值得在鼠疫的监测和快速诊断中推广应用。

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106-132和141-155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。

预测鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的CTL表位

目的预测鼠疫菌F1抗原的CTL表位,为鼠疫菌表位疫苗研究奠定基础,并为绘制鼠疫菌抗原表位图谱提供一种可行的研究手段。方法采用nHLAPred网络预测法对F1抗原的CTL表位进行预测。结果预测得到了鼠疫菌F1抗原的特异性CTL优势表位:120～128 SPKVNGENL和153～161 KLAAGKYTD。结论利用nHLAPred法,并结合其他T细胞表位预测方法,可得到抗原的CTL表位,准确率较高,可作为表位图谱绘制的有效工具。

鼠疫菌66Mdal质粒与鼠毒素及F_1抗原的关系

本文报道了在对147008号鼠疫菌及各突变株鼠毒素(F_2)和F_1抗原的检测中发现,66Mda1质粒决定鼠毒素和F_1抗原的产生。

重组鼠疫菌F1抗原在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

利用基因重组技术,用pET42(b+)质粒在大肠杆菌DE3中表达鼠疫菌F1抗原。经分析rF1抗原基因序列与天然F1抗原结构基因序列完全一致,电泳扫描测其表达量为25%:W estern B lot结果表明,rF1抗原可与F1特异性抗体相互作用,具有天然F1抗原的活性。用镍离子亲和层析纯化rF1抗原免疫BALB/c小鼠,在其血清中可检测到高滴度的抗F1抗体。

F_1抗原含量低的鼠疫菌株的生物学特性及其流行病学意义

应用反相间接血凝试验,我国17个生态型的544株鼠疫菌进行F_1抗原测定,结果有4株表现F_1抗原含量低。通过对其生物学特性研究,表明F_1抗原含量低菌株亦可引起(实验性)动物鼠疫.进行了流行病学分析。

ELISA双McAb夹心法检测鼠疫F1抗原

对应于同一F1抗原分子且不相互阻断的2株F1 McAb,分别制备酶标抗体并包被反应板,用于ELISA双McAb夹心法检测鼠疫F1抗原。以PcAb-RIHA和四步检查为对照,检测不含F1抗原的细菌8株,非鼠疫疫区8种动物的新鲜和腐败标本723份,检测结果全部阴性,和四步检查结果相同,PcAb-RIHA出现非特异反应45份。检测鼠疫强毒菌18株和感染鼠疫标本27份,GMT比PcAb-RIHA高2~4和2~3。本法特异性、敏感性、试剂稳定性均高于PcAb-RIHA。应用于鼠疫疫源地调查、疫情监测、人间疫情判定、细菌学研究效果良好。

HRP-F1McAb酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原应用效果评价

目的评价辣根过氧化酶标记鼠疫F1单克隆抗体(HRP-F1McAb)酶免疫染色技术检测小鼠脏器鼠疫F1抗原的应用效果。方法通过HRP-F1McAb酶免疫染色法检测鼠疫菌EV株感染小鼠脏器标本和对照小鼠脏器标本,同时用细菌学、RIHA和ELISA做平行检测。结果 HRP-F1McAb酶免疫染色法与细菌学一致率为96.36%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05);HRP-F1McAb酶免疫染色法和RIHA一致率为98.18%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05);HRP-F1McAb酶免疫染色法和ELISA一致率为96.36%,阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2=0),P>0.05)。结论酶免疫染色法检测小鼠脏器鼠疫F1抗原特异敏感、简单快速。

鼠疫F_1抗原的纯化及分子量测定的研究

提纯的鼠疫F_1—McAb与经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶Sepharose4B偶联,制备成F_1—McAb—Sepharose 4B亲和层析柱。将鼠疫F_1抗原粗品纯化后,经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,仅出现一条沉淀带,与标准蛋白分子量带比较测得鼠疫F_1抗原分子量为26kDls。

市售獭皮携带鼠疫菌及其F_1抗原水平的研究

本文对市售獭皮携带鼠疫菌及其F_1抗原的水平进行了研究。血清学检查獭皮标本21621份,细菌学检查2180份,结果全部阴性。

鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗。方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6mTn3xHA/lacZ转座文库质粒中,将此重组质粒经NotI酶切线性化,然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组,再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选。结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定,证明其为重组阳性转化子。结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统,用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原,为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件。

土壤保存鼠疫菌F1抗原的试验研究

本文报告利用放射免疫沉淀试验的竞争抑制原理,成功地从实验室保存了五年鼠疫菌的土壤中,检出F1抗原。检出F1抗原量可达340ng/ml。结果表明,该项试验较反向血凝方法敏感。

不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫效果的研究

目的研究不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫Balb/c小鼠,观察机体产生体液免疫和局部粘膜免疫反应的效果,为发展黏膜疫苗提供理论基础。方法鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原按比例分别与PorB(2类外膜蛋白)重组蛋白、蛋白体佐剂制备黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,取尾静脉血,采用ELISA检测血清IgG及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液sIgA;采用FAC检测脾淋巴细胞表型的变化。结果PorB重组蛋白佐剂疫苗组和蛋白体佐剂疫苗组较无佐剂组体液免疫抗体水平高、蛋白体佐剂疫苗组好于PorB重组蛋白佐剂疫苗组,但无显著性差异。结论PorB重组蛋白佐剂疫苗和蛋白体佐剂疫苗均能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫应答,且PorB重组蛋白佐剂疫苗免疫效果可与蛋白体佐剂疫苗相媲美,可进一步论证是否可用PorB重组蛋白佐剂替代蛋白体佐剂,这为鼠疫粘膜疫苗的研制奠定了基础。

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。

鼠疫耶尔森菌F1抗原的性质研究

鼠疫菌F1抗原是鼠疫亚单位新疫苗最重要的候选抗原,对其性质的充分认识,将有助于抗原制造工艺和新疫苗的开发。F1抗原的性质研究包括:微观结构,一级核苷酸、氨基酸序列,二级结构,高分子聚集形态,以及F1抗原的理化性质。

鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原（F1）的几种提取方法评价

鼠疫菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ）荚膜Ｆ１抗原的传统提取方法费时且成本较高，本文参考不同微生物表面蛋白的制备程序，观察了６种不同实验条件下该抗原的提取效果。结果表明，鼠疫菌湿菌用ＫＣＮＳ作为解离剂提取Ｆ１抗原，和传统方法的提取效果基本一致。由于省去了丙酮制备菌粉这一烦锁步骤，从而提取程序大为减化。