鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的纯化和复性研究(英文)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种造血生长因子和促炎细胞因子。重组鼠源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在抗肿瘤及抗炎研究中有着极其重要的作用。以NcoI和BamH I为酶切位点将mGM-CSF编码序列插入到pET-28a载体中。转染E.coli宿主菌BL21后得到以包涵体形式表达的蛋白,表达量占菌体总蛋白量51.6%。包涵体的纯化条件在实验中进一步优化,然后溶解于8 mol/L尿素中。采用稀释法在2 mol/L尿素缓冲液中添加PEG对蛋白进行复性。复性后的产物经过离子交换层析纯化后得到高纯度的有活性的mGM-CSF。通过体内白细胞计数和体外髓样细胞增殖检测表明纯化的蛋白具有mGM-CSF全部的生物活性。这种制备方法能够从每升发酵液中获得8.06 mg蛋白,具有蛋白表达量高,复性和纯化方法简便易得的特点,适用于规模生产。

bcl-2/bax凋亡基因诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡以及当归黄芪超滤膜提取物的干预作用

目的:观察当归黄芪超滤膜提取物对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖及对bcl-2/bax凋亡蛋白表达的影响。方法:用当归黄芪超滤膜提取物处理体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞,用MTS法检测培养24、48和72 h增殖率以及用westren bolt法检测bcl-2/bax凋亡蛋白。结果:当归黄芪超滤膜提取物可以促进颗粒细胞的增殖,并且呈一定的量效和时效关系,随着当归黄芪超滤膜提取物浓度的增加,其促增殖能力逐渐减低,最佳作用浓度0.375 g/L;选取最佳作用浓度,检测48 h的bcl-2/bax凋亡蛋白表达,发现bcl-2/bax为1.523。各组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:当归黄芪超滤膜提取物有促进卵巢颗粒细胞增殖作用,促进卵泡发育,提高血清激素水平,达到恢复卵巢功能的目的。

黄芪多糖调控Sirt1/FoxO1通路抑制多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬的研究

目的探究黄芪多糖(APS)调控沉默信息调节因子1/叉头状转录因子O1(Sirt1/FoxO1)通路对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠颗粒细胞自噬的影响。方法大鼠中分离卵巢颗粒细胞并经促卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,且CCK8检测APS对卵巢颗粒细胞增殖的影响。10-5mol/L丙酸睾丸酮、10μmol/L C2-神经酰胺作用大鼠卵巢颗粒细胞24 h诱导PCOS大鼠颗粒细胞自噬模型,CCK8检测细胞增殖情况;透射电镜观察自噬体情况;免疫印迹法检测细胞中Sirt1、Fox O1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达情况。结果免疫荧光检测显示,FSHR蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的平均阳性表达量93.18%>90%,可进行接下来实验。0、100、200、400μg/mL APS处理正常卵巢颗粒细胞,在贴壁0、24 h比较,细胞OD450差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比,模型组细胞核附近出现大量自噬小体,双层、单层膜包裹胞质形成封闭、圆形结构,部分自噬小体内膜溶解,自噬小体周围可见单层膜结构包裹着一些被降解的胞浆、类似自噬小体结构;100μg/mL APS组与模型组细胞结构类似,随着APS剂量的升高,自噬小体数量减少,在400μg/m L APS组时细胞正常。正常组、模型组、100、200、400μg/mL APS组在细胞贴壁0 h时,细胞OD450差异无统计学意义(P>0.05)。细胞贴壁24 h,与正常组相比,模型组细胞OD450降低(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,100、200、400μg/mL APS组细胞OD450升高(P<0.05),细胞中Sirt1、Fox O1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低(P<0.05)。结论APS可以抑制PCOS大鼠颗粒细胞自噬,可能是通过抑制自噬通路Sirt1/FoxO1实现的。

粒细胞减少小鼠大腿金黄色葡萄球菌感染动物模型的建立

目的建立粒细胞减少小鼠大腿动物感染模型。方法ICR小鼠腹腔注射不同剂量环磷酰胺,取外周血行白细胞分类计数;予小鼠大腿接种金黄色葡萄球菌标准菌ATCC29213,观察24h存活率、外周血粒细胞及肌肉菌量变化。结果环磷酰胺(150+100)mg·kg-1剂量组粒细胞数达到预期水平,连续4天低于100个.μL-1;对数生长期菌液百倍稀释后浓度约1×107CFU·mL-1;接种24h后,小鼠存活率75%,中性粒细胞数均显著升高;26h后,大腿组织菌量为3.55×108CFU。结论本文建立的粒细胞减少小鼠大腿感染动物模型特征稳定。

smad4和cyclinA蛋白在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达及当归黄芪超滤膜提取物对其的增殖作用

目的:观察smad4和cyclin A蛋白在体外培养大鼠卵巢颗粒细胞中的表达以及当归黄芪超滤膜提取物对其的增殖作用。方法:以不同剂量的当归黄芪超滤膜提取物作用于体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞,用MTS法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞24、48和72小时的增殖情况,并用westren bolt法监测smad4和cyclin A蛋白的表达。结果:smad4和cyclin A蛋白在颗粒细胞高表达,随着细胞增殖作用的增加,其表达也逐渐增加;当归黄芪超滤膜提取物可促进颗粒细胞的增殖,并且呈一定的量效和时效关系,最佳作用浓度为0.375g/L;各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:当归黄芪超滤膜提取物有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用,能促进卵泡发育,与上调smad4和cyclin A蛋白表达有关。

滋肾益经活血汤对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的观察滋肾益经活血汤对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法向培养的Wistar大鼠卵巢颗粒细胞中分别加入10%空白血清(对照组)、六味地黄丸含药血清(六味地黄丸组)、滋肾益经活血汤含药血清(滋肾益经活血汤组),培养24h。观察大鼠卵巢颗粒细胞形态的变化、颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达及颗粒细胞分泌E2、P水平的变化。结果与空白血清对照组和六味地黄丸组相比,滋肾益经活血汤含药血清组G0/G1期细胞均明显减少,而S期细胞则明显增多;E2、P的量明显升高;颗粒细胞bcl-2基因mRNA表达量均明显增多。结论滋肾益经活血汤能延缓卵巢颗粒细胞衰老,提高卵巢储备功能。

大鼠嗜碱性粒细胞在过敏反应研究中的应用

中药注射剂目前在临床上应用广泛,但诸多不良反应限制了其应用和发展。过敏反应是中药注射剂的主要不良反应,直接关系到中药注射剂安全性问题的解决。本研究综述了RBL细胞在过敏反应中的应用进展,期望能为中药注射剂的过敏反应的研究提供一些思路。

哈蟆油通过激活PI3K/Akt/NF-κB途径保护氧化应激损伤的大鼠卵巢颗粒细胞

本文探讨哈蟆油含药血清对H_2O_2致大鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的保护作用与分子机制。将大鼠原代卵巢颗粒细胞分为6组:正常对照组、H_2O_2模型组、阳性药对照组、哈蟆油含药血清低、中、高剂量组。CCK-8法检测哈蟆油含药血清对H_2O_2致颗粒细胞氧化应激损伤细胞活力的影响;实时荧光RT-PCR法检测PI3K、AKT3 mRNA的表达水平;Western blot检测p-Akt(Ser473)、NF-κB信号通路相关蛋白的表达。结果发现与正常对照组相比,H_2O_2刺激后细胞活性明显下降,哈蟆油含药血清能够提高颗粒细胞存活率。机制研究发现,哈蟆油含药血清通过恢复H_2O_2诱导细胞增殖相关PI3K、AKT3 mRNA水平,上调p-Akt(Ser473)、IKKβ、NF-κB(p65)蛋白的表达,下调IκBα蛋白的表达。以上结果表明,哈蟆油对H_2O_2诱导卵巢颗粒细胞氧化应激损伤具有保护作用,其作用机制可能与调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路密切相关。这可能是其抗氧化的作用机制之一。

小鼠骨髓来源的树突状细胞体外扩增与鉴定

目的 改进目前体外大量扩增树突状细胞(DC)的方法,以获得大量高纯度的树突状细胞,从形态学和免疫表型等方面给予鉴定。方法 用2 0ng/ml重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM CSF)诱导小鼠骨髓细胞体外分化为树突状细胞,用相差显微镜观察形态学变化,进行扫描、电镜观察和FACS检测细胞表面分子。结果 培养10d ,可获得大量典型DC ,经流式细胞仪检测,DC表达表面分子CD11C、CD80、MHCⅡ。结论 本实验方法可以获得大量高纯度的树突状细胞。

大鼠骨髓来源树突状细胞体外培养体系的优化

目的探讨优化大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)体外培养体系的方法。方法应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant rat GM-CSF,rrGM-CSF)20μg/L和重组大鼠白介素(recombinant rat interleukin,rrIL)-410μg/L诱导分化Lewis大鼠骨髓单个核细胞,获得未成熟DC(immature DC,imDC)。第6日加入终含量为100μg/L的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激细胞成为成熟DC(mature DC,mDC)。用倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表型、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测DC培养上清液中白介素(IL)-12、IL-10的含量,并以Brown Norway大鼠脾脏T淋巴细胞为反应细胞,做混合淋巴细胞反应检测,观察DC刺激T淋巴细胞增殖能力。结果经细胞形态学、流式细胞术及混合淋巴细胞反应三方面鉴定,证实所培养细胞为DC。体外培养第6日,见大量增殖细胞集落,细胞高表达OX62。LPS刺激细胞后,细胞伪足样突起明显增多,细胞逐渐呈半悬浮、悬浮生长,细胞表面高表达主要组织相容性抗原复合体(MHC)Ⅱ类分子和共刺激分子(CD40、CD86)。与imDC比较,mDC分泌IL-10和IL-12显著增加,刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力显著提高。结论通过采用调整rrGM-CSF和rrIL-4的用量等方法优化体外培养体系诱导大鼠骨髓单个核细胞,可分化出大量骨髓源性DC。

剔除目标成分的丹参注射液对大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞和大鼠过敏反应的影响

目的 探讨剔除目标成分后的丹参注射液对大鼠嗜碱性粒细胞白血病(RBL-2H3)细胞和大鼠过敏反应的影响。方法 选取RBL-2H3细胞,分别以25、50、100μg/ml的丹参和剔除目标成分后的丹参注射液处理24小时后,比较各组细胞脱颗粒、β-氨基己糖苷酶含量、组胺含量及蛋白(p-p38、p-cJNU、p-Syk)表达。将雄性SD大鼠随机分为丹参注射液组、剔除目标成分后注射液组、正常组和阳性对照组(天花粉蛋白)各8只,按照临床等倍剂量分别腹腔注射丹参注射液组、剔除目标成分后注射液组、生理盐水及天花粉蛋白。比较各组大鼠血清被动阿瑟斯反应、肺组织病理结构、组胺含量和总IgE浓度。结果 在RBL-2H3细胞中,丹参和剔除目标成分后的丹参注射液干预组RBL-2H3细胞的脱颗粒率、β-氨基己糖苷酶释放率、组胺含量和p-p38、p-cJNU和p-Syk蛋白的表达显著高于阴性对照组;相同浓度的丹参和剔除目标成分后的丹参注射液干预下,剔除目标成分后的丹参注射液组细胞中的这些指标显著低于丹参组,差异有统计学意义(P<0.05)。在SD大鼠中,丹参和剔除目标成分后的丹参注射液干预组SD大鼠被动阿瑟斯反应、肺组织病理损伤、SD大鼠血清和肺组织中组胺含量和总IgE浓度显著高于正常组;剔除目标成分后的丹参注射组显低于丹参注射组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 相较于丹参注射液,剔除目标成分后的丹参注射液可减弱RBL-2H3细胞和大鼠过敏反应。

当归补血汤含药血清对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达的影响

目的:探讨当归补血汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白以及氧化损伤的影响。方法:以不同剂量的当归补血汤含药血清作用于5μg/m L顺铂(Cisplatin,CDDP)抑制的体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞,用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]法检测各组颗粒细胞24 h、4 8 h、72 h增殖情况,及培养液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达情况。结果:CDDP对大鼠卵巢颗粒细胞有明显抑制作用,凋亡率可以达到70.50%。当归补血汤含药血清对颗粒细胞增殖有促进作用,2.5%当归补血汤含药血清作用4 8 h组最为显著(P<0.01);同时MDA和caspase-3蛋白也逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与当归补血汤低、高剂量治疗组比较,当归补血汤中剂量治疗组效果最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:当归补血汤对顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞增殖有促进作用,可能机制是抑制细胞氧自由基的产生,抑制Caspase-3蛋白表达,促进细胞增殖。

rmuGM-CSF增强巨噬细胞抗白念珠菌活性研究

目的 :研究重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rmuGM CSF)对巨噬细胞抗白念珠菌活性的调节作用。方法 :分别将浓度为 10 0 ,2 0 0 ,3 0 0 ,40 0U·mL 1 的rmuGM CSF与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养 2～ 5d ,然后测定巨噬细胞的抗白念珠菌活性。结果 :rmuGM CSF可增强巨噬细胞的抗白念珠菌活性 ,作用呈剂量依赖性 ,且随着与巨噬细胞共培养时间的延长 ,增强效应不降低。结论 :rmuGM CSF能增强巨噬细胞的抗白念珠菌活性 ,增强效应强而持久。

基于RBL-2H3模型分析过敏反应效应细胞激活的差异基因

构建IgE介导的大鼠嗜碱性粒细胞(rat basophilic leukemia,RBL)-2H3作为过敏反应细胞模型,并利用转录组测序分析比较RBL-2H3细胞激活前后的转录组基因差异,富集相关信号通路。IgE介导的RBL-2H3细胞激活后,过敏介质和细胞因子分泌显著提高;转录组测序得到RBL-2H3细胞激活前后的232个差异表达基因,其中有127个(54.74%)可进行基因功能注释;RBL-2H3细胞激活主要影响肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶、Janus激酶-信号转导与转录激活子、Toll样受体等信号通路,涉及的转录因子有MAP3K8、Nfkbia、Junb、Jun、Fos等。本研究建立了IgE介导的过敏反应体外细胞模型,并且通过对效应细胞转录组信息的全面分析和潜在靶点及信号通路的富集为过敏性疾病的防控治疗提供参考。

三氯生对原代大鼠卵巢颗粒细胞孕酮分泌影响的实验研究

目的:研究三氯生对原代大鼠卵巢颗粒细胞孕酮(P4)分泌功能的影响。方法:原代大鼠卵巢颗粒细胞培养备用。取备用的卵巢颗粒细胞采用不同浓度的三氯生(0、0.01、0.1、1μM)染毒。24 h后分别采用MTT法检测颗粒细胞的相对活力、酶联免疫法(ELISA法)检测颗粒细胞P4分泌水平、实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)及western blot法检测类固醇激素合成急性调节蛋白(St AR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)以及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)的基因及蛋白表达水平。结果:三氯生在本研究所采用的浓度范围内对颗粒细胞的活性并没有影响(P>0.05);三氯生(0.1、1μM)可抑制颗粒细胞P4的分泌,且呈现剂量依赖性下降(P<0.05)。三氯生(0.1、1μM)可使St AR的基因表达水平显著增高、P450scc的基因表达水平下降(P<0.05)。1μM三氯生可使St AR及P450scc的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。三氯生对3β-HSD的基因及蛋白表达水平皆没有影响(P>0.05)。结论:三氯生可抑制原代大鼠卵巢颗粒细胞的P4分泌,对类固醇激素合成关键分子的影响可能是其作用机制之一。

脱氢表雄酮对大鼠颗粒细胞激素生成的作用

为了探讨脱氢表雄酮(DHEA)对大鼠原代卵巢颗粒细胞激素生成及相关甾体生成酶的影响,采用机械法分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞,放射免疫分析法检测培养液中雌二醇、孕酮和睾酮的含量;Real-time PCR法检测类固醇代谢途径中3β-羟基固醇脱氢酶(3β-HSD)、17β-羟基固醇脱氢酶(17β-HSD)、CYP450 mRNA的表达变化。结果显示:10μmol/L DHEA处理48 h后可显著促进大鼠原代卵巢颗粒细胞雌二醇(P<0.05)、孕酮(P<0.01)和睾酮的分泌量(P<0.01);显著促进3β-HSD(P<0.01)和17β-HSD(P<0.05)mRNA的表达,CYP450 mRNA表达略有降低,但无统计学意义。说明外源性DHEA处理可能通过调节3β-HSD、17β-HSD和CYP450等相关酶的基因表达,进而影响大鼠原代卵巢颗粒细胞雌激素和雄激素的分泌。

hIL-2/mGM-CSF融合蛋白的构建及表达

目的 :构建hIL 2 /mGM CSF原核表达载体 ,获得具有hIL 2和mGM CSF活性的hIL 2 /mGM CSF融合蛋白。方法 :利用PCR重叠延伸术 ,将人白细胞介素 2 (hIL 2 )和鼠粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子 (mGM CSF)基因 ,通过 2个脯氨酸 (Pro)基因的中间接头连接起来 ,扩增出hIL 2 /mGM CSF融合基因 ,并克隆于表达载体pBV2 2 0和pLY4中。结果 :获得序列正确的hIL 2 /mGM CSF融合基因 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,表达率在 2 0 %左右。活性测定其hIL 2活性为 4 5×10 5U/mg ,mGM CSF活性为 3 85× 10 6U/mg。结论 :获得了具有hIL 2和mGM CSF活性的hIL 2 /mGM CSF融合蛋白 ,为研究hIL 2 /mGM CSF融合蛋白的新生物学功能奠定基础。

食物致敏性评价表达人IgE高亲和力受体αβγ的大鼠嗜碱性白血病粒细胞2H3细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定表达人IgE高亲和力受体alpha、beta和gamma链(human high affinity receptor containing alpha, beta and gamma chain,hFcεRIαβγ)的大鼠嗜碱性白血病粒细胞(rat basophil leukemia,RBL)-2H3细胞株。方法将包装好的载有hFcεRIαβγ慢病毒感染目的细胞RBL-2H3细胞,实时PCR检测细胞hFcεRIαβγ的表达水平,流式细胞仪分选hFcεRIα表达阳性细胞,并检测分选后细胞hFcεRIα的表达水平。结果成功构建重组慢病毒表达载体GV348-hFcεRIαβγ和慢病毒颗粒;慢病毒能够有效感染RBL-2H3细胞,hFcεRIαβγ在RBL-2H3细胞中成功表达,hFcεRIα在RBL-2H3细胞蛋白水平成功表达。结论初步构建了hFcεRIαβγ/RBL-2H3细胞,相较于RBL-2H3细胞,该细胞表达hFcεRIα,可与人血清IgE特异性结合,能够更好地应用于食品致敏性评价体系中。

Identification of the metabolite and cytochrome P450 isoforms involved in rat liver microsomal metabolism of TM208

To identify the metabolite and CYP450 isoforms involved in rat liver microsomal metabolism of TM208. The present study investigated the metabolism of TM208 and the effects of selective CYP450 inhibitors on the metabolism of TM208 in rat liver microsomes. Various specific inhibitors of CYP were used to identify the isoforms of CYP involved in the metabolism of TM208. The inhibitor of CYP2D and that of CYP2B had strong inhibitory effects on TM208 metabolism in a concentration-de- pendant manner, the inhibitor of CYP1A had a modest inhibitory effect, and the inhibitor of CYP3A seemed not to have an obvious inhibitory effect on TM208 metabolism. TM208 might mainly be metabolized by CYP2D and CYP2B in rat liver microsomes.