乙型肝炎病毒(adr亚型)转基因小鼠的研究

目的：制备含有２．０拷贝乙型肝炎病毒（ＨＢＶ，ａｄｒ亚型）基因组的转基因小鼠，为ＨＢＶ相关医学问题的研究准备实验动物模型。方法：应用受精卵原核显微注射的方法，产生ＨＢＶ转基因小鼠。用ＰＣＲ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ杂交、放射免疫、免疫组织化学以及亚显微结构分析等方法，研究外源基因在转基因小鼠体内的整合、表达以及复制。应用常规病理切片及血清生物化学方法分析转基因小鼠的病理学改变。结果：得到了４只整合有ＨＢＶ基因组的建立者小鼠，并证明ＨＢＶ基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传，在肝、肾组织内可特异性表达、复制，并在肝细胞内发现了Ｄａｎｅ颗粒。转基因小鼠的肝、肾组织未见明显的病理学改变。结论：获得了ＨＢＶ的转基因小鼠，其病毒基因可以表达，并有病毒颗粒形成。该小鼠对于ＨＢＶ的各个基因产物是免疫耐受的，其基本生物学特性与人类的ＨＢＶ携带者特征相似。

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能。方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后,琼脂糖电泳回收目的片段,用原核显微注射法将其注射入雄原核,制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder;免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果:成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后,出生并存活了11只新生鼠,经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠,命名为C57-TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配,进行传代培育,复合PCR法筛选阳性转基因小鼠,目前已传至F4代。结论:本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57-TgN(HBx)SMMU,它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。

乙型肝炎病毒(ayw型)转基因小鼠的建立

目的：建立遗传上稳定的、带有乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ亚型的转基因小鼠品系。方法：通过对受精卵显微注射进行基因转移的途径制备转基因小鼠，以ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＥＬＩＳＡ、组织切片免疫组化和透射电镜等方法，分析所导入ＤＮＡ在转基因小鼠体内的功能情况。结果：得到２１只建立者小鼠，在它们的血清中检测到了ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的存在，还在肝细胞中观察到了ＨＢＶ样病毒颗粒。结论：ＨＢＶ基因组ＤＮＡ已经整合至小鼠的基因组，其中的基因能够表达，整个基因组ＤＮＡ还能复制，并被有效地包装。

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒 x(HBx)基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠 ,用分子杂交法鉴定转基因小鼠 HBx的整合与表达。结果 建立了人 HBx基因转基因小鼠模型。经 Southern杂交鉴定得到 17只转基因首建鼠。自肝脏提取总 RNA进行 Northern杂交 ,结果显示 17只首建鼠肝脏中均有 HBx表达。结论 为从整体水平研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的作用机制及 HBx的反式激活作用机制提供了理想的动物模型。

鼠痘、小鼠肝炎和鼠仙台病毒感染症的国内流行情况及防控对策

为了解鼠痘、小鼠肝炎和鼠仙台病毒感染症这3种新纳入《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》鼠病在国内的流行情况,对这3种鼠病的文献资料进行了收集和分析。重点分析了3种鼠病在国内清洁级及以上级别的实验大、小鼠中的流行情况,同时对如何防控提出了建议和对策。这3种鼠病在国内清洁级或以上级别的实验大、小鼠中均有检出,应进一步提高实验大、小鼠屏障设施建设和管理的标准化和规范化水平,重视微生物监测的作用,有效提高实验大、小鼠的质量。

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的 :建立乙型肝炎病毒核心抗原 (ayw亚型 )转基因小鼠模型。 方法 :采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠 ,以 PCR、免疫组化和 H- E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合、肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果 :得到 6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者 (founder)小鼠 ,其中 1只在肝细胞核和胞浆均有 HBc Ag的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代 ,F1 代 10只小鼠中的 4只小鼠肝细胞有 HBc Ag的表达。 结论 :建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠 ,核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达 。

丁型肝炎病毒感染东方土拔鼠的实验研究

丁型肝炎病毒(HDV)原称Delta因子,是一种缺陷性RNA病毒。它的复制需依赖于乙型肝炎病毒(HBV)的辅助作用。由于HBV的体外细胞培养很难成功,故HDV的研究仅限于动物模型。Rizzetto等首先对黑猩猩进行HDV的实验感染并获成功。Summers等在东方土拨鼠(Marmota monax)中发现一种病毒,性质与HBV相似,称为土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV)。WHV可使土拨鼠患病毒性肝炎和肝细胞癌。Ponzetto等用慢性携带WHV的土拔鼠进行了HDV感染研究,发现WHV对HDV同样有辅助作用,故土拔鼠可作为研究人类肝炎和肝细胞癌的动物模型。目前,国内尚无HDV实验感染的报告。本文对HDV感染东方土拨鼠进行了实验研究,试图探讨土拔鼠丁型肝炎血清学及病理学改变,为提纯丁型肝炎病毒及其抗原提供实验材料。

双黄连、鱼腥草注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨双黄连、鱼腥草在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(murine hepatitis virus,MHV-3)是否具有抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测双黄连、鱼腥草的抗MHV-3活性。结果:双黄连半数中毒质量浓度(TC50)为6 100μg.m l-1,抗MHV-3病毒的半数抑制质量浓度(IC50)为304.9μg.m l-1;鱼腥草的分别为500、22.06μg.m l-1。治疗指数(TI)双黄连为20.07,鱼腥草为22.67。两种中药成分对MHV-3病毒的抑制作用均存在明显的量效反应关系(P<0.01)。结论:双黄连、鱼腥草在细胞水平有显著的抗MHV-3作用。

人乙型肝炎病毒(ayw型)全基因组转基因小鼠病理学观察

目的：观察乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ亚型全基因组转基因小鼠的肝、肾等组织的病理改变。方法：选取２４只１３～２５周龄的清洁级ＩＣＲ品系ＨＢＶ转基因小鼠及１５只正常ＩＣＲ小鼠为对照进行病理大体观察，并重点取肝、肾、脾、肺、心、脑、睾丸（卵巢）、唾液腺、肌肉和皮肤等组织，切片ＨＥ染色后进行光镜和透射电镜形态观察。结果：上述两种清洁级小鼠大体和光镜下各器官和组织未见有明显病变；两种小鼠移入普通级环境下饲养４周后肝脏等器官发生机会性感染的机会相似；透射电镜下所有被检转基因小鼠的部分肝细胞扩张的滑面内质网等处有ＨＢｓＡｇ样颗粒和Ｄａｎｅ样颗粒，部分转基因小鼠之肾小管上皮细胞内见类似病毒颗粒；肝、肾细胞内未见其他亚微病理损害。结论：所建成的ＨＢＶ转基因小鼠既能在肝（其次肾）细胞内产生ＨＢＶ样病毒颗粒，但又不产生明显病理损害。

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的 :建立可表达乙型肝炎病毒 (adr亚型 )包膜中蛋白的转基因小鼠品系。 方法 :通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒 (adr亚型 ) pre S2 - S基因的转基因小鼠。应用 PCR方法筛选乙型肝炎病毒 pre S2 - S基因转基因首建者 (founder)小鼠 ,再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性 ,PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育 ,并用 PCR法检测其子代小鼠。结果 :共注射受精卵 6 9枚。选取存活受精卵 5 8枚分别植入 4只假孕小鼠 ,产仔并存活 2 3只。经尾组织 DNA PCR筛选得到 5只整合 pre S2 - S基因的 founder小鼠 ,免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达 HBs Ag,进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论 :所建立的乙型肝炎病毒 (adr亚型 ) pre S2 - S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性 。

用重组病毒株建立鼠巨细胞病毒性肝炎的实验模型

用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠巨细胞病毒 (murinecytomegalovirus ,mCMV)性肝炎模型。20只BALB/c甲基强的松龙免疫抑制小鼠 ,腹腔接种1×106PFU病毒悬液 ,动态观察血单个核细胞和组织中mCMV感染及肝组织病理变化。结果 :①mCMV感染小鼠血单个核细胞中X -gal染色阳性细胞在48h时开始出现 ,第3天有所减少 ,在第6天达到高峰;②肝、肺、肾组织病毒感染72h后可见 ,在第12天斑点数最多 ,以肝组织病毒感染多见;③肝组织病变在病毒感染后96h开始出现 ,在第12天达到高峰。提示 :利用重组mCMV建立的mCMV性肝炎小鼠模型 ,在感染后2周仍保持较高感染水平 ,为CMV的研究提供了一个良好的实验模型。

两种不同组织嗜性的小鼠肝炎病毒组合抗原检测抗体的间接ELISA方法

目的研究不同组织嗜性的小鼠肝炎病毒（MHV）组合抗原检测抗体的间接ELISA技术。方法比较两种不同组织嗜性抗原和组合抗原为基础的检测MHV抗体水平。将呼吸型MHV-1、肠型MHV-JX和混合抗原包被酶标板后，检测不同MHV毒株感染抗体。结果两种抗原都能检测出相应的MHV抗体，但交互检测效果差；组合抗原能同时检测两种MHV抗体，组合抗原可以提高MHV感染的检出率。临床样品中呼吸型感染率40％-58％，呼吸型感染率22％-70％，两型的共感染率为为17％-30％。结论组合抗原可以用于MHV感染的诊断试剂。

小鼠肝炎病毒以不同途径感染4个品系小鼠的比较

用小鼠肝炎病毒A59株以滴鼻、灌胃、腹腔注射3种途径人工感染近交系小鼠(BALB/c小鼠、C57BL小鼠)、免疫缺陷小鼠(NIH-III小鼠、BALB/c-nu/nu小鼠),接种病毒后3、5、7、14、21、28d分别取各鼠的肝脏,提取肝脏总RNA,用RT-PCR方法检测小鼠肝炎病毒的感染情况。结果显示:腹腔注射病毒的小鼠在肝脏中能最早检测出病毒,其次是灌胃,滴鼻则最晚;另外,近交系小鼠及免疫缺陷小鼠感染后3d在肝脏中检测出病毒,而转基因小鼠则在感染后7d在肝脏中检测出病毒。

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的:利用显微注射方法产生整合庚型肝炎病毒(HGV)全基因的转基因小鼠,并研究HGV基因的遗传特性。方法:将含有HGV全长基因的载体线性化后,将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液,依常规方法进行显微注射,得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者(founder)小鼠,将founder小鼠与正常小鼠交配得到F代小鼠,随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果:共得到5只founder小鼠,其中4只与正常小鼠交配,得到F1代小鼠共41只,其中29只为阳性,阳性率为71％。F2代小鼠共21只,其中16只为阳性,阳性率为76％。结论:得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠,并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。

丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠的建立

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构基因在ＨＣＶ感染中的致病性，构建了中国丙型肝炎病毒５ＵＴＲ区与结构基因区（Ｃ＋Ｅ１＋Ｅ２）的表达质粒，并通过显微注射法将其接种入小鼠受精卵内制备转基因小鼠。共注射受精卵４１０枚，存活３１２枚，植入后产仔６０只；转基因鼠尾部组织ＰＣＲ法ＤＮＡ检测证明有靶基因的整合；转基因小鼠的肝、肾、脾、心、肺、小肠、血中均有靶基因的转录，而在脑组织中无转录。３只Ｇｏ代整合小鼠经与正常ＩＣＲ小鼠配种，获Ｇ１代小鼠３２只，其中１３只有ＨＣＶ结构基因的整合。这一结果表明，ＨＣＶ结构基因转基因小鼠动物模型已建成。

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的 :分析乙型肝炎病毒 pre S2蛋白在 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法 :采用原核显微注射法将质粒 pc DNA3.1- pre S/ St注射入小鼠受精卵雄原核 ,制备转基因小鼠。PCR法在基因组水平筛选 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠首建者 (founder)及后代 ;免疫组织化学法在蛋白水平检测 pre S2蛋白在这些小鼠中的表达 ;H- E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果 :经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后 ,共出生 15只新生小鼠 ,其中存活 7只 ,经 PCR检测后获得 2只 founder转基因小鼠 ,命名为 C5 7- Tg N (pre S/ St) SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有 pre S 2蛋白表达 ,H- E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这 2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配 ,进行传代培育 ,PCR法筛选阳性转基因小鼠 ,目前已传至 F2 代。 结论 :本研究成功建立了稳定遗传 3′末端缺失的 pre S/ S基因并表达 pre S2蛋白的转基因小鼠 C5 7- Tg N((pre S/ St) SMMU,它将是体内研究 3′末端缺失的 pre S/

大蒜新素注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨大蒜新素(allitridin)在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(mice hepatitis virus,MHV-3)的抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测大蒜新素的抗MHV-3活性,改变给药时间探索大蒜新素抗MHV-3作用环节。结果:大蒜新素半数中毒浓度(TC50)为75mg/L,抗MHV-3病毒的半数有效浓度(IC50)为2.7mg/L,治疗指数(TI)为27.78,大蒜新素对MHV-3病毒的抑制作用存在明显的量效反应关系(P<0.01),并且对MHV-3病毒有预防和中和作用(P<0.01)。结论:大蒜新素在L2细胞中对MHV-3病毒有明显的抑制作用,其作用机制是多途径的。

Toll样受体激动剂抑制土拨鼠肝炎病毒作用研究

目的研究Toll样受体(TLR)激动剂对土拨鼠肝炎病毒(WHV)复制的抑制作用。方法从WHV慢性感染的土拨鼠肝脏分离原代肝细胞,转染Poly I:C、CpG或直接用LPS刺激,Southern印迹检测WHV复制中间体,病毒保护试验检测细胞培养上清液中I型干扰素的水平;通过尾静脉注射Poly I:C、LPS、CpG到WHV转基因小鼠体内,提取肝脏DNA和RNA,实时PCR检测MxA和OAS1的mRNA水平。结果 Poly I:C、LPS和CpG在原代土拨鼠肝细胞和WHV转基因小鼠显著抑制病毒复制;Poly I:C、LPS和CpG处理后的原代肝细胞分泌高水平的I型干扰素,肝脏的MxA和OAS1 mRNA上调表达。结论TLR通路的活化通过诱导I型干扰素而发挥抗病毒作用,在抗HBV治疗中可能发挥重要作用。

乙型肝炎病毒X基因对大鼠肾小球系膜细胞增殖和肿瘤坏死因子α表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的蛋白HBx对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)及细胞增殖的影响。方法扩增HBVX基因,与pCI-neo载体连接,构建pCI-neo-X真核表达载体。采用脂质体法将其转染大鼠GMC,用Western blot法检测HBx的表达;以半定量RT-PCR测定体外培养大鼠GMCTNF-α mRNA的表达;采用ELISA法测定培养上清液中TNF-α的含量;MTT法测定细胞增殖。结果HBx在转染pCI-neo-X的GMC中表达,转染后36、48h HBx表达明显。转染pCI-neo-X组GMC TNF-α mRNA的表达明显高于未转染和空载体转染组。细胞转染pCI-neo-X后培养36、48h,上清液中TNF-α浓度分别为(185.3±70.7)、(140.3±42.1)pg/ml,而未转染组分别为(41.7±10.3)、(43.7±10.6)pg/ml,空载体转染组分别为(44.l±10.1)、(33.3±8.6)pg/ml,均明显低于转染pCI-neo-X组(均P<0.05)。转染pCI-neo-X后可诱导GMC出现增生反应,且在转染后36、48h最明显,与未转染和空载体转染组差异均有显著性意义(P<0.05)。结论HBx可诱导大鼠GMC增生,并在基因和蛋白水平上调GMC TNF-α表达。HBx对GMC的增殖作用可能与其诱导TNF-α的高表达有关。