腺病毒介导的人ING4基因诱导C6鼠胶质瘤细胞凋亡

目的:研究肿瘤抑制基因人ING4(inhibitor of growth family,member4)对C6鼠胶质瘤细胞的促凋亡作用。方法:将携有绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒空载体Ad及重组腺病毒Ad-hING4-His(由本科室构建)分别感染C6细胞,RT-PCR法检测hING4的转录,Western-blotting法检测目的蛋白的表达。并观测hING4基因表达对C6胶质瘤细胞的作用,用MTT法绘制生长曲线,计算抑瘤率。再取重组腺病毒Ad-hING4-His及空腺病毒Ad作用后的C6细胞分别行激光共聚焦显微镜观察凋亡小体、透射电镜观察亚细胞结构的变化,抽提基因组DNA行琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪检测。结果:Ad-hING4-His感染C6细胞后,RT-PCR及Western-blotting结果提示有目的基因的转录和表达。hING4基因表达可以显著抑制C6细胞生长。激光共聚焦观察可见明显核断裂、透射电镜可见实验组细胞呈凋亡表现、基因组DNA电泳呈现梯形条带,流式细胞仪检测有明显AP峰,凋亡率达18.1%。结论:hING4可以通过促进细胞凋亡作用而显著抑制C6细胞的增殖和生长。

血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。

重组腺病毒载体对大鼠胶质瘤细胞转染效率的影响

目的研究转染复数(MOI)和转染时间对重组腺病毒载体转染大鼠胶质瘤细胞转染效率的影响。方法体外培养大鼠胶质瘤细胞(C6细胞),用携带有rHSG基因的重组腺病毒载体(Adv-rHSG-GFP)转染C6细胞。根据MOI将细胞分为:A组MOI=0、B组MOI=10、C组MOI=50、D组MOI=80、E组MOI=100,转染Adv-rHSG-GFP 24h后分别收集每组细胞,采用Western Blot和免疫细胞化学法检测rHSG蛋白的表达,并通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察GFP阳性表达来评价重组腺病毒载体的转染效率。用MOI为100的Adv-rHSG-GFP转染C6细胞不同时间后(12、24、36和48h),同法收集细胞并检测rHSG蛋白的表达及评价重组腺病毒载体的转染效率。结果 Adv-rHSG-GFP转染C6细胞24h后,rHSG蛋白的相对表达量和绿色荧光蛋白表达随MOI值的增高而增多;用MOI为100的Adv-rHSG-GFP转染C6细胞后,12h即可观察到绿色荧光蛋白的表达,且在24h内随时间的变化而增高,在24~36h绿色荧光蛋白表达无变化,48h有所降低(P<0.01);rHSG蛋白相对表达量在12~48h内随时间的变化而增高,于48h达到最大值(P<0.01)。结论重组腺病毒载体能够有效转染C6细胞,且在MOI值为100,24h时有最高转染效率。

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞的趋化性实验

目的用Transwell细胞迁移实验观察骨髓间充质干细胞是否具有对C6大鼠胶质瘤细胞的趋向性。方法在Transwell培养板的Transwell上室中放置一定量的用B rdU标记的骨髓间充质干细胞,Transwell培养板的培养孔中分别放置:IMDM培养基、C6细胞条件培养液、MRC-5细胞、C6鼠胶质瘤细胞。将以上Transwell培养板在CO2恒温培养箱中培养2h后,然后取胰酶加入培养孔中消化细胞5min,拿掉Transwell上室,取适量细胞悬液滴加在载玻片上,然后将4%多聚甲醛滴加在载玻片上的细胞上将其固定30min,然后对载玻片上的细胞进行B rdU免疫组化染色(S-ABC法)。免疫组化染色处理后,用显微图像分析仪计数载玻片上的阳性细胞数。结果迁移到C6及其条件培养液组的骨髓间充质干细胞明显多于IMDM和MRC-5组,并有统计学意义上的差异,且C6及其条件培养液组之间也有统计学意义上的差异,IMDM和MRC-5组两组之间差异无统计学意义。结论实验表明骨髓间充质干细胞对C6细胞及其分泌的各种因子具有趋向性。

β-榄香烯体外诱导大鼠神经胶质瘤细胞热休克蛋白70的表达及肿瘤细胞的凋亡

目的探讨β-榄香烯体外对胶质瘤细胞的抑制作用及其机制。方法用MTT法观察β-榄香烯作用下大鼠神经胶质瘤细胞(C6细胞)生存情况；用FCM法检测C6细胞膜热休克蛋白70(HSP70)的表达及细胞周期；电镜观察瘤细胞的超微结构变化。结果(1)榄香烯组、丝裂霉素组、榄香烯+丝裂霉素组C6细胞的生存率均下降,生存的抑制作用呈剂量依赖性。(2)榄香烯组、榄香烯+热休克组C6细胞株胞膜上HSP70蛋白的表达率(63．88%、97．84%)均较对照组(平均4．72%)显著增高(P＜0．05)。(3)FCM检测经β-榄香烯(0．2mg/ml)处理的C6细胞S期细胞比例上升(53．80%),G_2-M期的细胞数目下降(4．67%),有亚二倍体峰(23．37%),电镜发现凋亡小体。结论β-榄香烯能抑制C6细胞的增殖,可诱导C6细胞膜HSP70蛋白的表达。使肿瘤细胞凋亡可能是其抗瘤效应的一个重要机制。

体外柴胡皂苷元d对C_6大鼠神经胶质瘤细胞前列腺素E_2生成的影响

目的 观察柴胡皂苷元d(saikogenind ,SGD)对C6大鼠神经胶质瘤细胞体外前列腺素E2 (PGE2 )生成的影响。方法 用放射性免疫法测定细胞产生的PGE2 ,液体闪烁测量法测定14 C花生四烯酸 (AA)标记细胞释放14 C AA。结果 SGD在 1～ 2 0 μmol·L-1范围内 ,抑制由钙离子载体A2 3187诱发C6大鼠神经胶质瘤细胞前列腺素E2 (prostaglandinE2 ,PGE2 )释放 ,其IC50 为 3μmol·L-1,但对花生四烯酸 (arachi donicacid ,AA)释放无影响。SGD不影响细胞微粒体组分将AA转化为PGE2 。结论 SGD抑制由钙离子载体A2 3187诱发体外C6大鼠神经胶质瘤细胞PGE2 产生 ,但不抑制AA释放和直接抑制环氧脂酶 (cyclooxygenase ,COX)活性。

IL-12家族亚基基因在大鼠C6胶质瘤细胞表达研究

目的:对大鼠C6胶质瘤细胞应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)法观察白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)家族亚基基因的表达,为今后IL-12家族在脑胶质瘤方面研究奠定基础。方法:提取大鼠C6胶质瘤细胞RNA,反转录成c DNA,应用q PCR法观察IL-12家族亚基基因在大鼠C6胶质瘤细胞mRNA表达影响并进行比较分析。结果:在大鼠C6胶质瘤细胞中,IL-23a,IL-12a的表达丰度为高,EBI3,IL-27的表达丰度为中,IL-12b的表达丰度为低。结论:IL-12家族与胶质瘤发生、发展密切相关,其中IL-12、IL-23是最有潜力治疗脑胶质瘤的细胞因子,其研究进展将为脑胶质瘤的免疫治疗带来新思路。

冰片联合顺铂对大鼠C6胶质细胞瘤的治疗作用

[目的]探讨冰片联合顺铂对大鼠C6胶质细胞瘤的治疗作用。[方法]建立大鼠C6胶质瘤细胞模型,于治疗组给予灌服冰片及静脉注射顺铂,21天后分析治疗组与对照组胶质瘤横截面积。[结果]治疗组脑胶质瘤的横截面面积明显小于对照各组(P<0.05)。[结论]冰片能增加血脑屏障对顺铂的通透性,从而提高顺铂对胶质细胞瘤的治疗作用。

缺氧诱导C6大鼠脑胶质瘤细胞亲环素A蛋白表达及其意义

为了探讨缺氧诱导C6大鼠脑胶质瘤细胞亲环素A(Cyclophilin A,CypA)表达水平的改变及其意义。本实验分别于正常(对照)及缺氧(缺氧组)环境培养C6细胞,利用蛋白印迹和RT-PCR技术检测CypA蛋白和mRNA的表达情况;在此基础上,利用RNA干扰技术和MTT技术检测抑制缺氧环境所诱导的CypA蛋白表达对C6细胞增殖的影响。结果显示:缺氧环境诱导C6细胞CypA mRNA和CypA蛋白表达上调,缺氧环境培养1h开始上调,12h达到顶峰;用CypA-siRNA干扰C6细胞CypA表达48h后,C6细胞CypA蛋白水平明显被抑制,细胞增殖能力较对照组显著下降(P<0.01)。本研究表明,缺氧可诱导C6细胞CypA表达水平上调,抑制CypA表达则可降低C6细胞的增殖能力。由此提示,CypA可作为胶质瘤治疗的新靶点。

姜黄素对高糖培养下大鼠神经胶质瘤细胞C6中p53、Siah-1和突触素蛋白表达的影响

目的:体外研究姜黄素对高糖培养下大鼠神经胶质瘤细胞C6中抑癌基因p53、E3泛素连接酶Siah-1和认知相关蛋白突触素(Synaptophysin)表达的影响。方法:采用CCK-8法检测10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μmol/L姜黄素在高糖培养下作用C6细胞24、48 h后的细胞存活率。采用Western blot法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测作用24 h后正常对照组(无任何处理)、高糖培养组和姜黄素低、高浓度组(高糖+10、30μmol/L姜黄素)细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白及mRNA的表达情况;另同法检测高糖培养下小干扰RNA(siRNA)沉默C6细胞中p53基因后对Siah-1蛋白及mRNA表达的影响。结果:姜黄素在10～40μmol/L浓度范围内对C6细胞存活率无明显影响,大于40μmol/L浓度后呈浓度依赖性降低细胞存活率。与正常对照组比较,高糖培养组C6细胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表达增强,Synaptophysin蛋白及mRNA表达减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);与高糖培养组比较,姜黄素低、高浓度组C6细胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表达减弱,Synaptophysin蛋白及mRNA表达增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。高糖培养下,沉默p53基因后的C6细胞中Siah-1蛋白及mRNA表达均明显减弱(P<0.05)。结论:高糖条件下,姜黄素可通过下调C6细胞中p53、Siah-1表达,进而上调Synaptophysin表达。

DL型丁胱亚磺酰亚胺对大鼠C_6神经胶质瘤细胞放射增敏效应研究

目的 研究有氧及乏氧状态下DL型丁胱亚磺酰亚胺(DL BSO)对大鼠C6神经胶质瘤细胞的放射增敏效应。方法 以60 Coγ射线为放射源 ,分有氧和乏氧状态下单纯照射组、加药照射组。采用细胞克隆形成方法观察DL BSO对神经胶质瘤细胞的放射增敏效应。结果 有氧状态下 ,DL BSO的放射增敏作用和药物作用时间有关。 0 1mmol·L-1DL BSO用药 2、6、12h ,未能观察到放射增敏作用 ,放射增敏作用仅在用药后 2 4、4 8h出现。乏氧状态下 ,0 1mmol·L-1DL BSO用药后 ,各时间点 (2～ 4 8h)均可见放射增敏效应。有氧、乏氧状态下不同浓度DL BSO的放射增敏作用和药物浓度有关。结论 DL BSO对有氧及乏氧状态下的大鼠C6神经胶质瘤细胞均有放射增敏作用。离体状态下 ,DL BSO主要表现出乏氧增敏作用 ,并呈现一定的时间、浓度依赖关系。

悬浮法培养C6胶质瘤细胞系和该细胞系中脑肿瘤干细胞的分离

目的研究应用无血清培养基悬浮法培养C6胶质瘤细胞系的方法;并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞,观察其生长方式和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法,在无血清培养基中采用悬浮法培养大鼠C6胶质瘤细胞系;再将分离获得的悬浮生长的脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基,观察其分化;应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例。结果C6胶质瘤细胞系中有约1.18%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球;这种细胞球具有人脑肿瘤干细胞球的特征,并可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的C6胶质瘤细胞系无明显差别。结论C6大鼠胶质瘤细胞系中含有比例较低的、具有增殖和分化能力脑肿瘤干细胞(约1.18%),该细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。

半胱氨酰白三烯受体激动剂和拮抗剂对大鼠胶质瘤C6细胞分化的作用

目的:探讨半胱氨酰白三烯受体在大鼠胶质瘤C6细胞的分化中的作用。方法:以激动剂LTD4、CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特以及分化诱导剂forskolin处理C6细胞,观察细胞形态及GFAP蛋白表达变化。结果:Forskolin(10μmol/L)可诱导C6细胞形态变化及GFAP蛋白表达(细胞分化),而LTD4(0.1～100 nmol/L)不能诱导这些变化;单用孟鲁斯特(1μmol/L)无明显作用,但与LTD4(100 nmol/L)合用可诱导C6细胞分化。结论:CysLT2受体可能参与调节大鼠胶质瘤C6细胞的分化。

海带硫酸多糖对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨海带硫酸多糖(LPS)对大鼠胶质瘤细胞(C6)的体外生长及细胞周期的影响。方法以不同浓度的LPS处理C6细胞,用细胞计数法测定细胞增殖情况,流式细胞仪记录细胞周期的改变,用比色法测定谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的含量变化。结果随着LPS浓度的增加与作用时间的延长,LPS使细胞增殖能力下降,细胞周期阻滞在G0/G1期,且LPS可以降低GSTs的活性。结论 LPS可明显抑制C6细胞的增殖,并通过阻滞细胞周期促进C6细胞凋亡;LPS还可抑制GSTs活性。

GDNF促进体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞增殖的时效及量效关系的研究

目的观察外源性胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）促进大鼠C6胶质瘤细胞增殖的时效及量效关系，为深入研究GDNF对C6细胞的促增殖机制提供最佳的时效及量效作用点。方法将体外培养的C6细胞分为空白对照组、溶剂对照组和实验组（GDNF浓度分别为10、30、50、70、90μg／L，作用时间分别为12、24、48、72h），用MTT比色法检测不同浓度GDNF通过不同作用时间对C6细胞增殖情况的影响。结果浓度在50μg/L以上的GDNF作用24h后，C6细胞增殖水平升高，在48h时达到高峰而后趋于平稳或呈下降趋势，与对照组比差异有统计学意义。其中，70μg/LGDNF作用48h后，C6细胞的增殖率明显高于其他实验组。结论外源性GDNF促进体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞增殖的最佳时效及量效作用点为浓度70μg/L、时间48h。

葡萄籽原花青素对大鼠C6胶质瘤细胞活性氧线粒体去极化和STAT3、Bcl-2、P53P21表达的影响

目的:探讨葡萄籽原花青素(GSP)对大鼠C6胶质瘤细胞活性氧、线粒体去极化和STAT3、P53、P21、Bcl-2 mRNA表达的影响。方法:采用水溶性四唑盐-1(WST-1)法测定GSP干预后C6胶质瘤细胞系的细胞活力,采用ROS指示剂荧光二氯荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)测定干预后C6胶质瘤细胞内ROS水平,采用线粒体膜电位指示剂5,50,6,60-四氯-1,10,3,30-四甲基苯并咪唑碳氰化物碘化物(JC-1)测定干预后C6细胞的线粒体去极化,采用定量PCR法检测GSP干预后C6细胞的STAT3、P53、P21、Bcl-2 mRNA表达。结果:GSP各浓度处理C6胶质瘤细胞去极化细胞百分比、STAT3、P53、P21mRNAbiaoda水平均高于空白组(0 mg/L)(P <0.05),WST-1检测OD值、DCF-MFI和Bcl-2 mRNA水平均低于空白组(0 mg/L)(P <0.05);50 mg/LGSP处理C6胶质瘤细胞去极化细胞百分比、STAT3、P53、P21 mRNA水平均高于25 mg/L(P <0.05),WST-1检测OD值、DCF-MFI和Bcl-2 mRNA水平均低于25 mg/L;75 mg/LGSP处理C6胶质瘤细胞去极化细胞百分比、STAT3、P53、P21 mRNA水平均高于25、50 mg/L(P <0.05),OD值、DCF-MFI和Bcl-2 mRNA水平均低于25、50 mg/L。结论:GSP可以降低C6胶质瘤细胞内ROS水平,诱导线粒体去极化,抑制Bcl-2表达,诱导P21、STAT3和P53表达,抑制胶质瘤细胞增殖效呈剂量依赖趋势。

蒿甲醚对SD大鼠原位脑胶质瘤的抑瘤实验

目的探讨蒿甲醚(Artemether)对SD大鼠原位脑胶质瘤的抑瘤作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度蒿甲醚对大鼠C6脑胶质瘤细胞株的生长抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50)。立体定位仪对48只(雌、雄各半)SD大鼠建立脑胶质瘤原位模型,随机分为6组:对照组;模型组,蒿甲醚33.3mg/(kg·d)、50.0mg/(kg·d)、66.6mg/(kg·d);联合用药组,蒿甲醚50.0mg/(kg·d)+硫酸亚铁1.5mg/(kg·d);阳性药对照组。采用灌胃给药法连续给予各组SD大鼠用药10天,对照组给予0.9%氯化钠溶液。肿瘤体积按a2bπз6(a为肿瘤的短径,b为肿瘤的长径)计算。全脑标本用4%多聚甲醛固定。肿瘤组织做病理观察。结果蒿甲醚抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖,其抑制作用呈剂量和时间依赖性;模型组和联合用药组对SD大鼠原位脑胶质瘤的抑瘤率分别为:54.5%、61.0%、64.5%和69.8%;模型组组间比较,蒿甲醚66.6mg/(kg·d)用药组的抑瘤率明显高于蒿甲醚33.3mg/(kg·d)用药组;各实验组间比较,联合用药组的抑瘤率显著高于模型组33.3mg/(kg·d)。结论口服蒿甲醚对SD大鼠脑部原位接种C6脑胶质瘤有明显的抑瘤作用。

蒿甲醚对大鼠原位脑胶质瘤抑瘤及抗血管生成的实验研究

目的探讨蒿甲醚是否在选择性地杀伤SD大鼠原位脑胶质瘤的同时还具有抑制血管生成的作用.方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度蒿甲醚对大鼠C6脑胶质瘤细胞株的生长抑制作用,计算半数抑制浓度(IC5)0;采用立体定位仪在48只SD大鼠大脑皮质层接种C6脑胶质瘤细胞(1×106个/μL),雌、雄各半;随机分为3组,每组8只.分别为空白对照组、阳性对照和实验组.在接种第3天后,实验组各组采用灌胃给药法连续给药10 d;于接种后的第20天解剖大鼠,经活体左心室灌注4%多聚甲醛,固定肿瘤的全脑标本.在大鼠脑部接种穿刺点做冠状切口,按垂直和水平方向测量肿瘤大小.肿瘤体积=a2bπ/6(a为肿瘤的短径,b为肿瘤的长径).采用免疫组化方法检测移植瘤组织微血管密度.结果实验组各组对SD大鼠原位脑胶质瘤的抑瘤率分别为:54.5%、61.0%、64.5%和69.8%,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);各实验组血管计数均明显少于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01).各实验组SD大鼠原位脑胶质瘤体积较空白对照组显著减小.结论在一定剂量范围内,口服蒿甲醚对SD大鼠脑部原位接种C6脑胶质瘤有明显的抑制作用;蒿甲醚抑制原位脑胶质瘤生长的机制之一可能是透过血脑屏障抑制脑胶质瘤血管生成.

蒿甲醚抗SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成的实验

目的探讨蒿甲醚(Artemether)抗SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定不同浓度蒿甲醚对大鼠C6脑胶质瘤细胞株的生长抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50)。采用立体定位仪在SD大鼠大脑皮质层接种C6脑胶质瘤细胞(1×106/μl)40只,雌、雄各半;随机分为5组,每组8只。在接种第3天后,各组采用灌胃给药法连续给药10天。于接种后的第20天解剖大鼠,经活体左心室灌注4%多聚甲醛,固定肿瘤的全脑标本。在大鼠脑部接种穿刺点做冠状切口,按垂直和水平方向测量肿瘤大小。肿瘤体积=a2bπ?6(a为肿瘤的短径,b为肿瘤的长径)。全脑标本用4%多聚甲醛固定,肿瘤组织做病理观察,免疫组化方法检测移植瘤组织微血管密度。结果各实验组血管计数分别为Ⅰ组(39±4),Ⅱ组(29±6),Ⅲ组(12±8),Ⅳ组(10±5),生理盐水组为(52±7)。各实验组血管计数均明显少于生理盐水对照组,差异有统计学意义(分别P<0.05,P<0.01)。各实验组SD大鼠原位脑胶质瘤体积较对照组显著减小。结论在一定剂量范围内,蒿甲醚具有明显抑制SD大鼠原位脑胶质瘤血管生成作用;蒿甲醚抑制原位脑胶质瘤生长和转移的机制之一是透过血脑屏障抑制脑胶质瘤血管生成。

胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学观察

目的 探讨胶质瘤血瘤屏障体外模型的形态学特征。 方法 利用电镜技术观察血管内皮细胞ECV30 4 和C6 胶质瘤细胞共培养 (混合共培养、Transwell共培养、Transwell膜两面共培养 )后的内皮细胞的孔窗、内皮细胞之间的连接及内皮细胞与肿瘤细胞的相互关系、瘤细胞的“血管周足”等的形态学特征 ;并与 4例人脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障进行比较。 结果 电镜下发现ECV30 4 细胞经与C6 细胞按 3种不同方式共培养汇合后均为无孔窗型内皮细胞 ,细胞间出现紧密连接 ;Transwell共培养的膜上C6 细胞未见伸出伪足突向膜的微孔 ;经膜两面共培养的瘤细胞则可通过Transwell的微孔突向内皮细胞侧 ,但瘤细胞未伸出伪足包绕内皮细胞或突入内皮细胞间隙 ,瘤细胞的“血管周足”不完整 ,后两者与脑胶质瘤组织标本的血瘤屏障的形态特征相类似。 结论 在体外经Transwell膜两面共培养的ECV30 4 和C6 胶质瘤细胞的系统可在一定程度模拟体内的血瘤屏障的形态学特征。